m6A介导YTHDC2调控ZNRD1--AS1/miR--942/TNS1轴促香烟烟雾致肺癌的机制研究
背景与目的:肺癌是全世界癌症致死率高的的最常见肿瘤，尽管近年来临床治疗技术取得了一定的进步，患者预后仍未能获得显著改善，5年生存率仍很低。同时，肺癌的发生发展也是世界范围内的一个重大公共卫生问题，吸烟是肺癌发生发展的第一大诱因。本课题组前期的研究结果表明长期香烟烟雾暴露能够诱导人永生化支气管上皮细胞BEAS-2B发生恶性转化，表现为细胞增殖和迁移能力的增强以及细胞的凋亡逃逸，裸鼠皮下成瘤实验也证实细胞的恶性程度。同时在恶性转化细胞中观察到DNA甲基化和组蛋白修饰以及miRNAs表达模式等表观遗传学修饰均发生改变。与DNA上的甲基化修饰相似，RNA上也存在甲基化修饰，并且其在肿瘤发生发展中的作用也越来越受到人们的重视，这种RNA水平的修饰被称为“表观转录组学”。m6A甲基化修饰是一种高度动态和可逆的过程，涉及负责写入m6A被称为“Writer”的甲基化酶，去甲基化的被称为“Eraser”的去甲基化酶以及识别m6A位点被称为“Reader”的阅读蛋白（统称为“WER”）。三者共同维持细胞内m6A水平的稳态平衡。本课题旨在探究肺细胞恶性转化过程中m6A修饰相关WER的表达和m6A修饰水平的变化及m6A介导的相关下游调控机制和功能影响，重点探讨吸烟相关的m6A阅读蛋白YTHDC2在肺癌中的功能及其靶向LncRNAZNRDI-ASI的作用机制。同时结合多个数据库分析YTHDC2和ZNRDl-AS1及下游通路轴在肺癌组织中的表达变化以及二者的临床意义，为寻找肺癌治疗新靶点提供科学依据。 方法:(1)探究香烟烟雾致人肺细胞恶性转化中m6A修饰模式和相关WER表达的改变及其意义:前期研究已构建香烟烟雾致人永生化支气管上皮细胞（BEAS-2B）恶性转化的模型，通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定不同染烟代数细胞中mRNA整体m6A水平;荧光定量PCR(qPCR)检测不同染烟代数细胞中m6A修饰相关“WER”基因的表达:高通量蛋白组学技术分析不同染烟代数细胞中的差异表达蛋白;甲基化免疫共沉淀(meRIP)技术分析烟致恶性转化细胞中差异m6A修饰RNAs改变情况。 (2)分析m6A阅读蛋白YTHDC2在恶性转化细胞及肺癌中的表达及其临床意义:qPCR和westernblot技术分析不同染烟代数细胞中YTHDC2的mRNA和蛋白表达变化;利用TheCancerGenomeAtlas(TCGA)和GeneExpressionOmnibus(GEO)数据库肺癌相关数据集分析YTHDC2在肺癌中的表达变化和拷贝数变化及其与临床病理特征的相关性:利用Kaplan-Meierplotter在线工具分析YTHDC2的表达水平与肺癌患者总体生存率(OS)之间的关联;免疫组化(IHC)分析组织芯片中70个肺癌患者组织样本及其配对正常组织中的YTHDC2表达，并使用ImageJ进行定量分析;Taqman法测定不同染烟代数细胞中YTHDC2的拷贝数变异。 (3)体内外实验分析与验证YTHDC2的功能:采用CRISPR-cas9技术构建YTHDC2基因敲除细胞系，蛋白组学技术分析敲除细胞系中的差异表达蛋白;使用RNA免疫共沉淀(RIP)技术拉下与YTHDC2结合的RNAs，进一步通过高通量测序鉴定这些RNAs;使用DAVID在线工具进行富集分析;构建YTHDC2过表达质粒，通过转染过表达质粒和YTHDC2siRNAs分别过表达和敲低YTHDC2;分别采用流式细胞术和EdU细胞增殖实验分析各组细胞的细胞周期和增殖能力;通过划痕实验和transwell细胞迁移实验分析各组细胞的迁移能力;人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞体外管形成实验分析各组细胞的促血管生成能力;qPCR和westernblot技术分别用于分析各组转染细胞的增殖和迁移相关分子表达;使用免疫荧光技术分析各组细胞中Ki-67的蛋白水平;通过裸鼠成瘤实验探究过表达YTHDC2对细胞成瘤能力的影响;进一步通过免疫组化分析瘤体中的增殖迁移相关蛋白表达改变。 (4)筛选YTHDC2下游靶LncRNA并探究其功能及意义:通过meRIPPCR和Pull-down技术获得LncRNAZNRDI-ASI并验证YTHDC2与ZNRDl-ASI的结合;RNA稳定性试验，即通过放线菌素D抑制各组细胞转录后通过qPCR测定细胞内RNA含量，分析YTHDC2对ZNRDI-ASI稳定性的调控;进行ZNRD1-AS1在GEO和TCGA数据库及染烟细胞中的表达分析（同第2部分方法），探究免疫影响和预后意义;进行ZNRDl-ASI的体内外功能分析（同第3部分方法）;荧光原位共杂交(FISH)和核质分离实验分析ZNRDl-ASI的亚细胞定位。 (5)m6A修饰对ZNRD1-AS1表达影响以及ZNRDl-AS1的下游竞争性内源RNA(ceRNA)调控机制研究:使用SRAMP在线工具预测ZNRDl-ASI中的m6A位点，并通过meRIPPCR/qPCR进行验证:通过甲基化抑制剂3．脱氮腺苷(3-DAA)或FTO抑制剂甲氯芬酸(MA)处理干扰m6A修饰水平，qPCR检测处理后的细胞中ZNRDI-AS1的表达变化;结合LncBase在线工具以及相关性分析预测ZNRDI-AS1的靶miRNAs;基于4个miRNA靶基因预测数据库以及相关性分析预测miR-942的靶基因;qPCR检测染烟细胞中miR-942和TNS1的表达;通过双荧光素酶报告基因实验验证其靶向关系:挽救实验验证它们之间的功能调控作用，增殖和迁移功能分析（同第3部分方法）;同时，生物信息学分析miR-942和TNS1的表达变化和预后意义。 结果:(1)香烟烟雾可致人肺细胞恶性转化中m6A修饰模式和相关“WER”表达出现改变:与正常传代对照人支气管上皮细胞（BEAS-2B细胞）相比，香烟烟雾长期暴露可致恶性转化细胞和肺癌H1299细胞中mRNA的m6A修饰减少;m6A修饰去甲基化酶ALKBH5和阅读蛋白YTHDC2在染烟致恶性转化细胞S30和肺癌细胞H1299中表达异常;在肺癌患者中，分析发现METTL3、FTO、YTHDC2和YTHDF1与患者吸烟史显著相关;此外，meRIP测序鉴定出多个在S30细胞中异常m6A修饰的mRNAs，且富集分析显示这些mRNAs显著富集在多个肿瘤相关信号通路和生物学进程中;结合蛋白组学鉴定的差异表达蛋白和meRIP鉴定的差异m6A修饰mRNAs再取交集后发现交集基因与细胞增殖、粘附和血管生成等肿瘤相关生物学功能相关。 (2)染烟细胞和肺癌组织中YTHDC2拷贝数和表达降低，并与肿瘤分期、转移和免疫细胞浸润以及患者预后相关:数据库分析显示吸烟患者的肺癌组织和染烟细胞YTHDC2均显著低表达;基于TCGA数据库的泛癌分析发现YTHDC2在多数癌症类型中均显著下调;组织芯片的免疫组化结果表明肺癌组织中YTHDC2蛋白表达下调;临床病理相关性分析表明YTHDC2低表达与肺癌分期、侵袭深度、远端转移和淋巴结转移等临床病理特征相关;临床意义上，YTHDC2高表达肺癌患者预后更好并且与免疫细胞浸润和免疫检查点基因表达相关;YTHDC2还显示出与多个抑癌基因的表达显著正相关;此外，我们还发现YTHDC2的低表达可能受到拷贝数缺失的调控。 (3)体内外实验表明YTHDC2可抑制细胞增殖、迁移和血管生成能力:CRISPR-cas9技术构建了YTHDC2敲除细胞系，蛋白组学分析鉴定出其中的差异表达蛋白;通过RIP-测序技术鉴定出与YTHDC2相结合的mRNAs和LncRNAs;进一步的富集分析表明敲除细胞中的差异表达蛋白与能和YTHDC2结合的mRNAs均显著富集在多条肿瘤相关信号通路和生物学进程，并且与RNA加工和稳定性相关;体外细胞实验表明，过表达YTHDC2能够显著抑制S30和H1299细胞的增殖、迁移和血管生成能力，而敲低则呈现相反结果;裸鼠成瘤实验也表明过表达YTHDC2能够抑制H1299的成瘤能力，并且促增殖和迁移相关蛋白的表达也降低。 (4)YTHDC2靶LncRNAZNRDl-AS1能够抑制细胞增殖和迁移能力:结合RIP测序和相关性分析鉴定出LncRNAZNRDI-ASI为YTHDC2潜在靶LncRNA;RNA稳定性实验表明YTHDC2过表达能够显著提高ZNRDI-AS1的稳定性;基于TCGA和GEO数据库的分析结果表明ZNRDl-ASI低表达与吸烟、肿瘤分期和淋巴结转移相关，并且与免疫细胞浸润和患者预后相关;LncBase预测得到ZNRDl-AS1的ceRNAs，富集分析显示它们与细胞周期和凋亡相关;FISH和核质分离实验证实ZNRD1-AS1在细胞核质中均有分布且细胞质中更丰富;进一步体内外实验证实ZNRD1-AS1过表达能够显著抑制肺恶性细胞的增殖和迁移及肿瘤生长。 (5)m6A修饰ZNRD1-ASI1过miR-942/TNS1轴调控细胞的增殖和迁移能力:通过SRAMP在线工具预测发现ZNRD1-AS1全长中含有m6A位点，meRIP实验也证实其中的m6A修饰;采用甲基化抑制剂3-DAA处理S30和H1299细胞能够显著下调ZNRD1-AS1的表达，而用去甲基化抑制剂MA处理则相反;此外，YTHDC2过表达能够显著挽救3-DAA处理所致的ZNRD1-ASI下调;数据库预测并通过实验证实miR-942为ZNRD1-AS1的靶miRNA，随后TNS1也被预测并证实其是miR-942的下游靶基因;进一步的双荧光素酶报告基因实验证实他们之间的靶向关系;功能分析显示miR-942过表达和TNS1敲低能够显著挽救ZNRD1-AS1过表达所导致的增殖、迁移能力的降低，进一步验证了ZNRD1-AS1/miR-942/TNS/轴及烟致肺癌的机制。 结论:长期香烟烟雾暴露能够诱导肺细胞m6A甲基化修饰水平改变;m6A甲基化阅读蛋白YTHDC2在染烟致肺恶性转化细胞和肺癌组织中拷贝数和表达下调，其表达水平与肿瘤分期、转移和免疫细胞浸润以及患者预后之间相关，具有抑制增殖、迁移和血管生成的作用;m6A修饰能够介导YTHDC2对LncRNAZNRD1-AS1的调控，从而调控肺恶性细胞的增殖和迁移及血管形成;YTHDC2可通过ZNRDl-ASl/miR-942/TNS/轴调控肺恶性细胞的迁移和增殖及影响肺癌预后。
肺癌;香烟烟雾;m6A介导;YTHDC2调控;ZNRD1轴;miR-942轴;TNS1轴
苏州大学
博士
卫生毒理学
李建祥
2022
中文
R734.2
2023-01-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）