苜蓿中华根瘤菌促进莱茵衣藻耐热的基因功能研究
自然环境中藻类可与细菌发生形式多样的相互作用，对双方的生长和功能产生重要影响，因此藻菌之间的相互作用是水体中重要的生态关系之一。然而，我们对藻菌相互作用的形式和机理依然缺乏深入认识。因此，采用遗传操作方便的模式藻类和细菌开展两者相互作用中的分子机制研究，对深入理解藻类和细菌在自然环境下的生态关系具有重要的科学意义。 前期研究表明某些产维生素B12(VB12)细菌可分泌VB12增强莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的耐热能力，使得莱茵衣藻能够在高温胁迫下存活。然而，我们对于该藻菌共生耐热过程中细菌其他关键基因的功能依然缺乏了解。本研究以易于遗传操作的模式菌株，苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti1021)，为实验材料，基于前期蛋白质组学分析结果，利用分子生物学技术对部分目标基因进行了筛选和功能探究。主要研究进展如下: (1)基于蛋白质组学分析结果，选择S.meliloti1021(Sm1021)在高温共生:高温单独培养(Sm1021-Co-H vs Sm1021-Si-H)、常温共生:常温单独培养(Sm1021-Co-N vs Sm1021-Si-N)比较时的上调差异表达蛋白。通过定点插入突变的方法构建40个单交换突变体，用于后续的功能实验来分析是否存在新的关键基因。 (2)将上述40个突变体与莱茵衣藻C.reinhardtii21gr（Cr21gr）进行共培养和高温处理，发现有4个基因（adhA、SMc02503、pccB、pccA）的突变体在共接种时不能促进Cr21gr的耐热能力，推测这些基因可能为Sm1021增强Cr21gr耐热能力的新的关键基因； (3)基因敲除突变体的构建。由于插入突变易发生重组而从目标基因脱落，致使突变体不稳定。本研究对上述基因利用同源双交换的方法构建较为稳定的敲除突变体。后期对这些双交换突变体与莱茵衣藻进行共培养表型验证，发现上述4个基因的突变体均不能促进Cr21gr的耐热能力，与上述表型一致。其中醇脱氢酶基因adhA突变体表型较为明显，将用于后期功能研究； (4)基因adhA功能的初步研究。构建了adhA基因互补表达载体并转入突变体，发现互补菌株恢复了促进莱茵衣藻耐热的表型，证实adhA基因确实在藻菌共生耐热中起到重要作用。对基因adhA功能初步研究结果表明，温度影响了突变体AadhA与Cr21gr共生条件下的生长状态，从而使突变体不能增强Cr21gr的耐热能力。 综上所述，本研究选取产维生素B12细菌S.meliloti102l与藻菌共生耐热相关的一部分差异表达基因，利用分子生物学技术构建了单交换插入突变体和敲除突变体，根据表型验证实验来筛选出新的关键功能基因，并针对其中的醇脱氢酶基因adhA开展了初步的功能研究。本研究为深入探究藻菌相互作用的分子机制提供了新的研究材料。
水体生态系统;藻类植物;细菌菌株;共生作用;分子机制
华中师范大学
硕士
微生物学
谢波
2022
中文
Q143.2
2023-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）