用于循环肿瘤细胞捕获的纳米笼状材料制备及性能研究
循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)是指从原发肿瘤或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞。从血液中高效捕获CTCs的新材料和新技术对癌症的早期诊断、预后监控、疗效评估、个性化治疗具有重要意义。由于CTCs在外周血中数量极低且具有异质性，导致目前依赖于特异性生物分子修饰的CTCs检测材料存在广谱性差、假阴性率高等问题。为了实现高效、广谱的CTCs捕获，本论文提出基于新型“纳米笼”材料与CTCs伪足之间结构、尺寸的匹配效应，以实现血液中CTCs无标记捕获的新思路。为了获得与CTCs伪足匹配的微纳结构，我们从天然花粉的多样性结构中获得灵感，通过对花粉外壁骨架进行改性、刻蚀处理，使其天然微纳结构充分暴露，并以此为基础制备了用于CTCs捕获的基底材料，进一步考察不同类型、尺寸的微纳结构对CTCs捕获的影响，探讨“纳米笼"结构高效捕获CTCs的机制，为无标记CTCs捕获新材料的研制奠定了理论和技术基础。具体研究工作如下: (1)针对天然花粉粒子微纳结构被覆盖、疏水性强且具有自发荧光等问题，以菊科植物花粉为模型，研究了浓硫酸对花粉粒子外壁骨架的刻蚀和改性效果。结果表明，浓硫酸刻蚀处理后，花粉外壁骨架的天然微纳结构充分暴露，比表面积显著增加，同时花粉粒子表面的-SO3H基团增多，C=O基团减少，导致其亲水性增强，自发荧光淬灭。通过对浓硫酸处理时间的优化，发现处理24h可获得表面亲水、无自发荧光、纳米结构完整清晰的微米级粒子，可进一步用于CTCs捕获基底材料的制备。 (2)以浓硫酸处理后的花粉微纳粒子为原料，采用喷涂法制备用于CTCs捕获的微纳基底材料。研究表明，将无水乙醇和聚乙烯缩丁醛作为微纳粒子的分散剂和粘合剂，可以在不覆盖粒子微纳结构的前提下喷涂出均匀、稳定的CTCs捕获微纳结构基底。为了筛选出有利于CTCs高效捕获的微纳结构，以具有代表性微纳结构的菊科、五味子科、睡莲科和蔷薇科花粉为原料，利用浓硫酸改性刻蚀法和喷涂法制备了具有不同微纳结构的CTCs捕获基底材料，考察其对模型癌细胞系MCF-7的捕获效率，发现菊科花粉的多层级微纳结构对癌细胞的捕获效果最佳。进一步详细考察菊科花粉不同层级微纳结构对癌细胞捕获效率、伪足产生时间和数量、细胞骨架分布、粘着斑蛋白表达的影响，最终确定了“纳米笼”结构对癌细胞高效捕获起到决定性作用。捕获时间为60min时，纳米笼基底对MCF-7癌细胞的捕获率高达91％，为目前无标记微纳材料中的最高值。 (3)从“纳米笼”结构诱导癌细胞伪足生长过程、不同尺寸“纳米笼”对癌细胞捕获性的能影响等角度进行考察，探究“纳米笼”结构高效捕获癌细胞的机制。研究发现表面入口孔径为175nm、支撑框架直径为117nm和内部联通空腔间隙为166nm的纳米笼结构，与平均直径为131nm的癌细胞伪足可以精确匹配，从而诱导癌细胞伪足进入到纳米笼内部充分运动和伸展，使之产生0.1-0.2μm2/根的粘附面积(为目前微纳材料材料的10倍)，使细胞.基底间的粘附力显著增加到22.9nN以上，从而显著地提高了癌细胞捕获效率。此外，纳米笼基底对不同种类的癌细胞系(MCF-7、A431、Hela、HepG2和A549)均显示出90％以上的捕获效果，证明其具有广谱的癌细胞捕获能力。 (4)为了实现“纳米笼"结构基底在临床检测中的应用，首先考察了其在模拟血液环境中的CTCs捕获效果。结果表明“纳米笼"结构基底对血液中的白细胞表现出较好的抗粘附性能，可以在含有大量白细胞(106)的模拟血液环境中选择性地捕获出少量癌细胞(20-4000)，捕获率达到92％，证明其具有良好的特异性。同时，“纳米笼”结构基底还表现出良好的细胞相容性，捕获的癌细胞在其表面显示出97％以上的存活率和良好的增殖能力。在此研究基础上，将“纳米笼”结构基底应用于CTCs临床检测，在早期乳腺癌患者4mL血液样本中CTCs检出率达到90％，在覆盖8种癌症类型(肺癌、喉癌等)的中晚期患者2mL血液样本中实现了100％的CTCs检出率，证明该材料具有临床应用潜力。 本论文从天然花粉的微纳结构出发，制备并筛选出了具有“纳米笼”结构的高效CTCs捕获材料，证实了“纳米笼”与CTCs伪足尺寸、结构的精准匹配是实现血液中CTCs高灵敏、选择性捕获的主要原因，并进一步应用在临床外周血样本检测中，证明了该材料在对CTCs检测的灵敏性和广谱性，为癌症早期诊断及治疗过程监控的CTCs捕获材料的开发提供了全新的理论和技术基础。
纳米笼状材料;制备工艺;循环肿瘤细胞;捕获性能
大连理工大学
博士
生物化工
贾凌云
2021
中文
R318.08
2023-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）