弓形虫ROP16Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ蛋白对人肺腺癌细胞A549的表型影响及其作用机制研究
背景：肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。肺腺癌是最常见的亚型，约占肺癌的40％，其发病率及死亡率呈逐渐上升趋势。目前的治疗手段存在一定的局限性，如手术治疗适合早期患者，放射治疗和化学疗法副作用大，靶向治疗过程中耐药基因的出现以及免疫治疗只有少部分产生免疫应答等问题。因此，寻找新型肺腺癌的治疗手段是当前研究的热点。大量数据表明，某些寄生虫及相关组分具有抗肿瘤的作用，如弓形虫、疟原虫、旋毛虫以及克氏锥虫等。棒状体蛋白16(ROP16)作为弓形虫入侵宿主细胞的重要毒力因子，在弓形虫感染时可分泌并迅速进入到宿主细胞核，调控宿主信号转导。课题组前期研究发现弓形虫RH菌株速殖子裂解液具有抗肿瘤作用，进一步分析发现其关键因子为ROP16，提示ROP16蛋白可能具有抗肿瘤作用，但具体机制尚不清楚。 目的与方法：为了探究ROP16蛋白对肺腺癌的抗肿瘤作用及机制，本研究拟通过基因工程技术构建弓形虫rop16Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ重组载体并在293T细胞中包装扩增，后将重组慢病毒载体转染至肺腺癌细胞A549，并通过RT-PCR、western blot等技术检测rop16基因在A549细胞内的表达情况，之后通过一定浓度的嘌呤霉素筛选出稳定表达ROP16蛋白的A549细胞;利用cck-8、流式细胞术、TUNEL、Transwell小室实验和细胞划痕实验探究ROP16蛋白对肺腺癌细胞A549细胞增殖、周期、凋亡、侵袭和迁移等细胞表型的影响，并通过RT-PCR、western blot检测ROP16蛋白对细胞周期相关蛋白p21、CDK6、CyclinD1，细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、p53、Cleaved Caspase3、Caspase9以及p-STAT3表达的调控作用来确定ROP16蛋白调控A549细胞表型的具体作用机制;通过提取肺腺癌原代细胞进行ROP16蛋白功能的验证。 结果：(1)已成功制备过表达rop16Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ重组慢病毒载体，之后转染肺腺癌细胞A549，已成功筛选出过表达rop16Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ的A549稳转株，并且ROP16蛋白可以在A549细胞中稳定表达。 (2)Ⅰ型和Ⅲ型ROP16蛋白抑制肺腺癌细胞A549细胞增殖能力，调控细胞周期相关蛋白p21、CDK6、CyclinD1的表达进而导致A549细胞周期在G1期停滞，而Ⅱ型ROP16蛋白对A549细胞增殖和细胞周期无明显影响。 (3)Ⅰ型和Ⅲ型ROP16蛋白调控肺腺癌细胞A549细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、p53、Cleaved Caspase3、Caspase9的表达，诱导细胞凋亡。Ⅱ型ROP16蛋白对A549细胞凋亡则无明显作用。 (4)Ⅰ型和Ⅲ型ROP16蛋白抑制肺腺癌细胞A549细胞侵袭和细胞迁移能力，而Ⅱ型ROP16蛋白对A549细胞侵袭和迁移则无明显影响。 (5)Ⅰ型和Ⅲ型ROP16蛋白上调肺腺癌细胞A549细胞内STAT3磷酸化水平，进而影响其表型变化，而Ⅱ型ROP16蛋白则无此作用。 (6)ROP16蛋白对肺腺癌原代细胞调控作用与在肺腺癌细胞A549细胞内的一致。 结论：Ⅰ型和Ⅲ型ROP16蛋白可通过STAT3信号通路调控肺腺癌细胞A549细胞表型，抑制A549细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移能力，诱导细胞发生周期停滞和细胞凋亡，而Ⅱ型ROP16蛋白则对A549细胞表型无明显影响。原代细胞实验结果趋势与之一致。
弓形虫ROP16蛋白;人肺腺癌细胞;表型变化;抗肿瘤作用
宁夏大学
硕士
微生物学
赵志军;曾瑾
2022
中文
R734.2;R730.3
2022-10-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）