里氏木霉内质网应激响应调控纤维素酶诱导表达的研究
木质纤维素作为地球上存在最为丰富的可再生生物质资源，可广泛用于化石燃料能源的替代以及大宗生物基产品的生产，其高效降解转化是实现其工业化应用的关键环节。自然界中包括腐生真菌在内的很多微生物具有超强的木质纤维素降解能力，里氏木霉（Trichodermareesei）就是其中的优秀代表，其目前也是纤维素酶及半纤维素酶主要的工业生产菌株。里氏木霉纤维素酶的表达受到多种环境因素包括碳源种类的影响，因而处于一个复杂转录调控网络的严谨控制，深入解析和全面阐述其高效合成机制将有利于通过理性遗传改造来提高里氏木霉（半）纤维素酶生产水平。然而目前针对转录层面的改造，包括通过强启动子过表达纤维素酶及其转录激活因子、敲除或敲低其转录抑制因子等策略并没有使纤维素酶产量达到预期水平。 作为一类分泌蛋白，纤维素酶基因转录翻译后的分泌效率同样可能影响合成酶的最终胞外水平。内质网(endoplasmicreticulum，ER)是蛋白质分泌路径的首个加工场所，其质量控制是实现细胞蛋白质稳态的重要保障。当内质网中蛋白质的加工折叠因扰动而失衡，则会引发内质网应激（ERstress，ERS），并由此引发未折叠蛋白响应(unfoldedprotemresponse，UPR)来缓解或消除内质网的负荷。分泌应激下的转录负反馈抑制（repressionundersecretionstress，RESS）就是其中一种响应现象，但其精确调控机制并不清楚。为探究里氏木霉纤维素酶表达过程中的RESS过程机制以及UPR信号通路关键组份的生理功能特征，本论文的主要内容及取得的研究结果如下: 1确定里氏木霉纤维素酶表达分泌过程中引发ER应激会触发RESS 首先分析了里氏木霉纤维素酶诱导过程中添加DTT引发ER应激条件下的纤维素酶基因转录，发现DTT处理可以导致以cbh1为代表的分泌蛋白基因转录水平显著下降，从而验证了里氏木霉纤维素酶存在ER应激下的RESS现象。为进一步分析转录下调是否具有启动子特异性，我们将内源cbh1的启动子替换为组成型启动子，对重组菌株的DTT处理发现转录下调现象可明显缓解，由此确定DTT引发的转录下调是通过特异性作用于纤维素酶基因启动子发生的;为进一步模拟细胞正常生理活动下非折叠蛋白累积引发RESS的情形，我们构建了表达4个半胱氨酸突变为脯氨酸的CBHI突变体(CBHI△4)的里氏木霉菌株。结果表明，CBHI△4的表达同样可以引发ER应激，并同时导致内源cbh1转录水平下降。与DTT处理类似，将内源cbh1启动子替换为组成型启动子同样可以缓解RESS，说明内源蛋白的错误折叠也会在里氏木霉纤维素酶分泌表达过程中引发启动子特异性的负反馈转录调控。 2对RESS转录调控机制进行了分析探究 因为里氏木霉中RESS呈现启动子特异性调控的特点，同时我们发现DTT处理也显著下调了纤维素酶基因关键转录激活因子xyr1的表达，我们分析了过表达Xyr1对RESS的影响。结果发现Xyr1的过表达仅可部分恢复RESS对cbh1的转录抑制。荧光分析表明DTT引发的ER应激并没有影响过表达Xyrl的胞内蛋白水平:进一步的染色质免疫共沉淀（ChIP）分析表明Xyr1的启动子结合活性也没有受到ER应激的影响，暗示RESS在主要影响xyr1转录本水平的基础上，还可能通过一种尚未知的信号路径影响Xyr1结合启动子后的转录激活活性。 3探究了里氏木霉UPR关键调控因子Ire1和Hac1的生理功能探究及其在纤维素酶基因表达中的作用 为了探究UPR途径关键调控因子Ire1和Hac1在里氏木霉正常生理活动及纤维素酶诱导表达中的作用，我们通过条件性RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)分别对两个基因的表达进行敲低，结果表明两干扰菌的固体生长、生孢及抗逆应激均没有受到显著影响，但与hac1干扰菌株液体生长严重受到影响不同，干扰ire1表达仅导致菌株前期生长缓慢，而其后期可恢复到野生型水平。Ire1和Hac1功能缺陷均导致菌株纤维素酶的胞外分泌水平明显下降，进一步的转录分析表明此种下降主要发生在转录水平。进一步通过在干扰菌中原位替换cbh1启动子为gpd启动子（cbh1g），发现cbh1的转录水平不再受基因敲低的影响而显著下调，推测Ire1和Hac1功能缺陷可能在纤维素酶诱导表达中触发了RESS。对启动子置换菌株中Ire1和Hac1干扰后纤维素酶酶活和胞内外蛋白水平的分析结果表明，组成型表达的CBHIg可以部分恢复Hac1功能缺陷带来的酶活显著下降，最终胞外酶活水平达到对照菌的50％。与此相反，ire1干扰菌株的pNPC酶活则一直处于极低水平。通过Westemblot对胞内蛋白的分析发现，干扰hac1的表达会导致明显的CBHIg胞内累积，而ire1表达的降低则导致胞内CBHIg水平明显低于对照菌。上述结果表明Hac1及Ire1的功能缺陷可能导致分泌蛋白在ER转运、折叠、加工和运出等环节出现紊乱并引发纤维素酶诱导过程中发生RESS。
里氏木霉;纤维素酶;内质网应激;未折叠蛋白响应
山东大学
硕士
微生物学
刘巍峰;张伟欣
2022
中文
Q949.327.606
2022-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）