转录激活因子Xyr1增强表达与内质网分泌途径改造对里氏木霉纤维素酶表达分泌影响的研究
木质纤维素生物质作为自然界中最为丰富的可再生资源，在新能源的开发过程中有着广阔的发展前景。然而，纤维素酶的高成本一直是限制生物质转化的主要障碍。丝状真菌里氏木霉是当前纤维素酶工业生产的主要宿主，但其木质纤维素分解酶分泌能力依然无法满足工业生产的需求，因此亟待进一步提升里氏木霉菌株的纤维素酶表达分泌能力。 作为里氏木霉主要的分泌蛋白，纤维素酶的产生受到从基因转录、蛋白翻译、翻译后修饰到蛋白分泌等不同层次的复杂调控。己知Xyr1是调控纤维素酶基因表达的主要激活因子，但其调控的精细机制尚未完全阐明，尤其是该因子表达剂量与纤维素酶基因表达调控相关性研究仍需深入探索。同时，纤维素酶作为里氏木霉主要的分泌蛋白在其分泌过程中需要经过内质网的蛋白折叠与分选，然而，内质网分泌途径在纤维素酶表达分泌上的功能也没有被系统性探究。因此，从基因转录水平（Xyr1转录调控）和蛋白分泌水平（内质网分泌途径）两个层面同步探索纤维素酶表达分泌机制对促进里氏木霉高效合成分泌纤维素酶具有重要的指导意义。 基于以上分析，本论文主要开展了以下两方面的研究: (1)通过不同程度增强表达转录激活因子Xyr1探索了其对里氏木霉纤维素酶表达分泌的调控作用及其相关机制。分别利用三种不同启动子Pegl2(中等强度诱导型启动子）、Pcbh1(强诱导型启动子）、PcdnaI(强组成型启动子）对xyr1进行了增强表达,所构建的菌株分别命名为QCDX、QCBX、QE2X。RT-qPCR、CHART-PCR以及酶活和糖化实验显示:①三种菌株中xyr1基因转录水平被不同程度增强，依次为QE2X＜QCBX＜QCDX,且菌株纤维素酶活力均得到提升，但值得关注的是WW表达最低的QE2X菌株，其纤维素酶活力显著强于另外两个强表达菌株。②改造菌株中纤维素酶组分基因的转录水平与xyr1的表达量成反比，即QE2X菌株的提升效果最为明显，而xyr1表达程度最高的QCDX菌株中酶组分基因的转录水平提升效果最不显著，且QE2X中cbh1、egl1启动子的染色质结构更加开放，推测在QE2X中Xyr1与纤维素酶基因启动子的结合更加高效。QE2X中自身启动子更加开放，由此可以推测里氏木霉中存在一种调控Xyr1表达的负反馈机制。③QE2X菌株在以未脱木素玉米芯材料为底物时其葡萄糖释放量提升了57.2％，且Cip1、Cip2等木质纤维素降解辅助蛋白的表达水平上调。上述结果表明，对xyr1进行中等强度的增强表达能够实现纤维素酶系的高效合成且其发酵液对木质纤维素材料的糖化效果显著提升。 (2)借助可控及增强诱导型启动子研究了内质网蛋白分泌途径靶点基因在纤维素酶分泌过程中的功能。选择内质网蛋白转运、折叠与分选紧密相关的sec62、sec63、pdi1、pdi2、bip1、enx、uggt、os9、cue1共9个基因作为靶点。①利用铜离子响应启动子Ptcu1构建了耙点基因可控型表达菌株。RT-qPCR证实，无铜离子外源添加时靶点基因表达增强，添加适量铜离子后靶点基因表达被抑制，因此实现了对靶点基因的可控表达。进一步研究显示，sec63基因的抑制会导致严重的内质网压力，且会严重损害里氏木霉的纤维素酶分泌能力;而cnx的抑制会激活UPR响应并显著增强纤维素酶分泌能力。②利用强诱导型启动子Pegl2研究了分泌途径靶点基因的增强表达对纤维素酶生产能力的影响。菌株分析发现，除cue1增强表达菌株OEcue1外,其他增强表达菌株具有更强的内质网压力耐受性。与出发菌株相比，OEsec63、OEpdi2、OEbip1、OEuggt菌株显示出更强的纤维素酶分泌能力，其总酶活分别提高39.3％、41.9％、25％、38.5％。③进一步选择与纤维素酶分泌相关性高的两个靶点基因sec63、bip1,利用中等强度诱导型启动子Pegl2在xyr1改良的纤维素酶高产菌株中进行增强表达，纤维素酶总酵活又分别提升了21.1％和18.3％。 本研究结果表明，通过从基因转录到蛋白成熟分泌等多个层面入手，可以进一步优化现有纤维素酶高产菌株的生产能力，并且内质网分泌途径改造也是改善里氏木霉纤维素酶生产的一种有效策略。
里氏木霉;纤维素酶;转录调控;内质网分泌途径
山东大学
硕士
微生物学
钟耀华
2022
中文
Q936;Q814
2022-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）