假交替单胞菌隐性次级代谢产物挖掘体系的构建
微生物天然产物及其衍生物为心血管疾病、癌症、细菌和病毒感染等疾病的治疗以及农业生产上的杂草、害虫等防治作出了很大贡献。他们的结构、生物活性及作用机制复杂多样，使其在新型药物开发中具有重要地位。近年来，多重耐药细菌的流行，对新型抗生素等药物的研发提出了更高的需求，然而天然产物出新率低，近几十年来被应用于临床的抗生素中仅有少数具有新骨架。海洋中蕴藏着丰富的生物资源，其独特的低温低氧高盐高压环境使海洋微生物通过次级代谢等产生抗逆作用，从而使代谢产物的合成、结构和活性更加新颖。变形杆菌作为海洋中微生物的主要分布类群，能够产生许多具有抗菌、抗病毒、抗生物膜、防污和抗癌活性的天然产物，是活性天然产物的主要来源之一。基因组学和代谢组学分析发现海洋微生物基因组上具有大量隐性次级代谢产物的生物合成基因簇，激活这些隐性合成途径进一步挖掘海洋微生物代谢潜力对于新型天然产物的发现及新药开发具有重要意义。 本研究聚焦于海洋变形杆菌金黄色假交替单胞菌PseudoalteromonasflavipulchraS16中新型活性天然产物的挖掘。对P.flavipulchraS16进行代谢组学和基因组学分析，发现除已知化合物alterochromides的生物合成途径外，基因组上有13个未知天然产物的生物合成基因簇，且大多与已知基因簇的相似度较低，具有合成新型天然产物的潜力。利用ExoCET技术对新颖的沉默基因簇BGC8(40kb)进行直接克隆和修饰，导入三种异源宿主E.coliGB05-MtaA、P.putidaKT2440和S.brevitaleaDSM7029中表达，但未检测到新化合物产生。因此，我们通过单交换重组对P.flavipulchraS16基因组上的沉默基因簇进行原位激活，将两种启动子Palt和Pery分别插入BGC8核心基因上游，但仍未产生新的产物。 然后我们对菌株S16进行了转录组测序，对内源型强启动子进行了活性分析和筛选，并将其用于沉默基因簇的原位激活。对不同培养时间点的P.flavipulchraS16进行转录组测序，选择33个转录水平位于前3.3％的基因上游的启动子作进一步分析。分别将33个内源启动子亚克隆到自杀载体pR6K-attP-phiC31-fluc上，并整合在荧光素酵报告基因fluc上游。同时通过单交换重组及SacB反向筛选将attB位点整合到菌株S16基因组上己知化合物alterochromides生物合成基因簇的核心区域，在引入att"B位点的同时对alterochromides生物合成途径进行了失活，以构建荧光素酶基因定点整合且代谢背景较低的突变菌株。之后将带有不同启动子和fluc基因的质粒转入菌株S16,通过PhiC31整合酶介导attB与attP的位点特异性重组将启动子筛选质粒整合到基因组上。然而，由于PhiC31定点整合系统在菌株S16中效率非常低或不能工作，只获得了含有P7启动子的质粒通过启动子区域的单交换重组整合到基因组上的重组菌株。于是将带有启动子和fluc基因的自杀质粒的pR6K复制子替换为可复制的pBR322复制子并通过接合转移将质粒导入PflavipulchraS16中，荧光素酶活性测定表明启动子P7、P18、P29和P32具有较高的活性。 为了进一步验证内源启动子的有效性，本研究通过单交换重组和SacB反向筛选将P7启动子插入P.flavipulchraS16基因组上7个沉默基因簇的上游，包括4个PKS/NRPS杂合基因簇BGC1、BGC3A、BGC8、BGC7和3个NRPS基因簇BGC2、BGC3B、BGC9。对发酵粗提物进行HPLC-MS分析发现BGC9被成功激活，产生了多个新化合物，化合物的结构、生物活性和生物合成机制有待进一步研究。本研究利用启动子筛选和基因组编辑，在P.flavipulchraS16中成功建立了隐性次级代谢产物的挖掘体系，为P.flavipulchraS16和其他海洋细菌的活性次级代谢产物挖掘提供了有效的途径。
天然产物;假交替单胞菌;异源表达;启动子筛选;原位激活;生物活性
山东大学
硕士
微生物学
张友明;颜富
2022
中文
R284.1
2022-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）