冰岛硫化叶菌FHA结构域蛋白SisFha及其互作蛋白SisvWA1在DNA损伤应答中的功能研究
硫化叶菌（Sulfolobus）作为生活在高温和低pH下的极端古菌，其染色体DNA受到损伤的概率大，但其自发突变率与大肠杆菌相似，表明其具有高效的DNA修复系统。古菌中与信息处理有关的过程，包括DNA复制、修复、转录及蛋白质翻译等与真核生物相似，但这些过程中的蛋白组分比真核生物的简单。对硫化叶菌DNA损伤应答的研究可以作为真核生物DNA损伤应答研究的重要参考，也有利于对极端古菌抗逆机制的全面了解。 含有FHA结构域的蛋白能够通过该结构域特异性地结合其他蛋白的磷酸化苏氨酸(pThr)，从而在三域中发挥多种功能。在真核细胞中，许多参与DNA损伤应答的蛋白包含FHA结构域，并涉及磷酸化位点的结合及磷酸化信号传递。迄今为止，古菌中仅有两个含FHA结构域的蛋白被研究:东工大硫化叶菌Sulfolobustokodaii的ST0829和嗜酸热硫化叶菌Sulfolobusacidocaldarius的ArnA，它们均与磷酸化介导的蛋白互作及鞭毛基因表达调控有关，其中ArnA在营养胁迫下调控鞭毛基因的表达。前期磷酸化蛋白组学数据显示，硫化叶菌的许多DNA损伤修复蛋白被磷酸化，说明磷酸化调控在硫化叶菌DNA损伤应答中十分重要。SisFha作为冰岛硫化叶菌中唯一包含FHA结构域的蛋白，可能参与磷酸化依赖的DNA损伤应答。 本文主要围绕模式古菌冰岛硫化叶菌REY15A中SisFha蛋白在DNA损伤应答中的功能展开，以扩展FHA结构域在古菌中的功能认识，尤其是其在DNA损伤应答中的功能，加深对古菌乃至真核生物DNA损伤应答的认识。本研究取得了以下主要结果: (1)SisFha具有结合磷酸化位点的结构基础 对三域中的FHA结构域进行序列保守性分析，FHA结构域的序列保守性低，但其结合pThr的位点保守性较高，这些位点在SisFha的FHA结构域中保守，表明SisFha具有结合磷酸化位点的结构基础。 (2)SisFha蛋白参与DNA损伤应答，作为部分DNA损伤应答基因的负调控因子发挥作用 使用多种DNA损伤剂处理Sisfha敲除菌株，其敏感性发生不同的变化。选择NQO作为损伤剂处理细胞，对其进行流式细胞术和细胞聚集度分析，结果显示相对于E233S菌株，Sisfha敲除菌株的死细胞比率减少，且细胞聚集程度增加，表明Sisfha的缺失提升了细胞对NQO的抵抗力。RT-qPCR及基于报告基因lacS的启动子活性分析显示，Sisfha的缺失有利于DNA损伤应答基因orc1-2、tfb3和ups基因的表达，尤其是ups。此外，SisFha的过表达菌株对NQO更加敏感，这与Sisfha敲除菌株表型相对应。 (3)SisFha与多种功能的蛋白质相互作用 对SisFha进行体内蛋白共纯化及蛋白质谱鉴定，发现SisFha的潜在互作蛋白种类很多，其中包括可能与细胞周期调控相关的蛋白激酶SiRe_2030、细胞分裂蛋白CdvA、与染色质稳定性相关的Sis7d(SiRe_0668)、保护DNA断裂以维持基因组完整性的反向旋转酶SiRe_1124及含介导蛋白互作结构域vWA的SisvWA1和SisvWA2等。通过pulldown实验进一步验证了SisFha与SiRe_2030、Sis7d、SisvWA1和SisvWA2的相互作用。 (4)SisvWA1与SisFha共同参与DNA损伤应答的调控 构建SisvWA1和SisvWA2单敲菌株及Sisfha/SisvWA1、Sisfha/SisvWA2、SisvWA2/SisvWA1双敲菌株，使用NQO处理。△SisvWA1和△Sisfha/SisvWA1对NQO均有更强的抵抗力，与△Sistha的表型相同;而△SisvWA2表型与△Sisfha不同。这表示SisvWA1与SisFha在DNA损伤应答中共同作用。 (5)SisvWA1和SisFha对upsX启动子结合力更强 利用电泳迁移率实验分析SisvWA1和SisFha对DNA损伤应答中转录上调的orc1-2、tfb3、upsX基因启动了、转录下调的orc1-1启动子、无转录变化的SiRe_1719启动子的结合能力，结果表明SisvWA1对这些启动子均有非特异性结合，而SisFha仅对upsX启动子有明显结合。另外，SisvWA1与SisFha同时存在可以增强对upsX启动子的结合。 综上，冰岛硫化叶菌SisFha蛋白参与调节细胞对DNA损伤的抵抗力，且这种调节可能需要SisvWA1的协同作用，从而对DNA损伤应答基因（特别是ups）的启动子进行结合与调控。
冰岛硫化叶菌;FHA结构域;vWA结构域;DNA损伤应答;蛋白磷酸化;敲除菌株
山东大学
硕士
微生物学
李爱英;倪金凤
2022
中文
Q55
2022-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）