氧化还原伴侣调控P450酶催化活性的结构机制研究
细胞色素P450酶(简称P450或CYP)是一类在自然界中广泛存在的含亚铁血红素的单加氧酶，能够在温和条件下对各种复杂有机化合物进行兼具位点和立体特异性的氧化，在天然产物生物合成、异源代谢、工业催化等方面发挥着重要作用，是一类多才多艺的生物催化剂。因其在环保、化工、医药等领域均有很大的应用前景，近年来已逐渐成为生物催化领域研究的热点。 Ⅰ型P450酶为了激活分子氧，需要借助氧化还原伴侣将两个电子有序地从NAD(P)H传递到P450酶的活性中心，其中双电子载体铁氧还蛋白还原酶(FdR)接受来自NAD(P)H的两个电子并依次还原两当量的铁氧还蛋白(Fdx)，单电子载体Fdx与P450直接相互作用，并依次传递两个电子。因此，作为Ⅰ型P450酶行使催化功能所必须的电子穿梭载体，Fdx和FdR是影响P450催化效率的重要因素。 随着后基因组时代的到来，全基因组测序技术飞速发展，越来越多的氧化还原伴侣基因被发现和鉴定，这为筛选提高P450酶催化效率的高效还原伴侣系统提供了有利条件。但不同的氧化还原伴侣组合如何影响P450酶对底物的催化，以及影响电子传递效率的关键机制尚不清楚，尤其在电子传递蛋白为独立FdR、Fdx的Ⅰ型P450酶系统中相关研究更少。本论文利用结构生物学和体外酶反应重构的方法，结合其他生化实验对该科学问题展开了较为系统的研究。 第一部分为氧化还原伴侣影响电子传递的结构机制研究。分别解析了来自细长聚球藻的FdR0978和来自委内瑞拉链霉菌的FdR2690、FdR2141的晶体结构。FdR0978与另外两种FdR的结构相比，在电子传递中发挥关键作用的辅基FAD所在作用面处于开放状态，便于Fdx中的铁-硫簇靠近以完成高效的电子传递。 第二部分为FdR影响P450酶催化效率的机制验证。首先利用随机组合的氧化还原伴侣与P450s。2进行体外酶反应重构实验，确定了较为合适的铁氧还蛋白Fdx1499;然后在不同FdR的条件下，辅助P450scaa2对美伐他汀进行羟基化以生产降胆固醇药物普伐他汀，经HPLC分离分析发现，全长及截短的FdR0978所在组合底物转化率最高(94.9％和96.4％)，而FdR2690和FdR2141所在组合仅能实现9.O％和26.9％的底物转化，该结果很好地验证了FdR的特殊结构在电子传递中的重要作用。在此基础上，构建筛选出了一种包含柔性linker的融合氧化还原伴侣Fdx1499-FdR0978，能实现P450sca2对美伐他汀的高效转化。 第三部分解析了自养无枝酸菌的P450羟化酶CYP-PA1的晶体结构。此前的研究己解析了其同源蛋白CYP-sb21的结构，并通过理性设计对其进行了改造，但是副产物CsA-9-OH的生成并未减少，这对实现以目标产物CsA-4-OH作为高效毛发生长促进剂的生产应用非常不利。该部分解析了同样对CsA具有位点选择偏好的CYP-PA1的晶体结构，通过结构比较和序列分析，找到了其偏好产生CsA-9-OH的可能关键氨基酸。 综上，本研究解析了三种FdR(2690、2141、0978)的晶体结构，并通过体外酶反应重构实验验证了FdR影响P450催化效率的可能结构机制:筛选到一种Fdx1499-FdR0978融合蛋白能够实现P450sca2对美伐他汀的高效转化;解析了CYP-PA1的晶体结构，为后续CYP-PA1和CYP-sb21的定向进化奠定了理论基础。
细胞色素P450;铁氧还蛋白;铁氧还蛋白还原酶;晶体结构;生物催化
山东大学
硕士
微生物学
武大雷
2022
中文
Q559.9
2022-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）