沙门氏菌双组分系统QseEF信号转导与Ⅲ型分泌系统底物分选机制探究
沙门氏菌是一种常见的食源性肠道致病菌，可以感染人畜并引发食物中毒、伤寒等疾病。在过去的几十年中，伴随着抗生素的过量使用，沙门氏菌对传统抗生素的耐药性急剧增强，所以针对沙门氏菌开发新型抗感染药物的需求也愈发迫切。新型抗感染药物的开发策略是:针对致病菌的关键致病元件进行靶向抑制，减弱其侵染能力或毒力，但并不影响细菌存活，从而降低病原菌致病能力并减缓耐药菌的产生。基于此策略，双组分系统(TCS)和Ⅲ型分泌系统(T3SS)成为针对沙门氏菌开发抗感染药物的重要靶点。本研究分为两个部分，第一部分针对沙门氏菌感知环境压力调控GlcN6P合成、增强毒力效应的双组分系统QseEF的信号转导机制展开研究，第二部分针对致病毒力元件Ⅲ型分泌系统的核心组分SctV家族蛋白参与T3SS组装与底物分选的机制进行研究。本研究的主要内容与成果如下: 1.通过构建QseF和QseE的不同截短体，成功获得QseEF胞内复合物，明确了QseF依靠RD结构域与QseE的DHp-CA结构域发生相互作用，其相互作用需要σ54相互作用域或者BeF3-的协助才可以发生;QseE磷酸基团结合位点His259突变为Glu259后也有助于其与QseFRD结构域形成复合物。 2.由于膜蛋白自身的独特性质，体外重组表达的产量一般较低。本研究通过构建SctV蛋白嵌合体ISS(InvATM-SsaVL-SsaVc)解决了其表达量低的问题。除此之外，鉴于膜蛋白跨膜区域较强的疏水性，需要选择合适的去垢剂稳定其构象，为此本研究对不同的去垢剂进行筛选和组合，最终确定在去垢剂GDN中可以纯化获得稳定的符合生理状况下九聚体构象的嵌合体蛋白ISS，为进一步通过冷冻电镜技术解析其三维结构奠定了基础。 3.利用细菌共表达体系获得了沙门氏菌SPI-2T3SS分子伴侣/门控蛋白SpiC-SsaM/SsaL复合物，对该复合物进行限制性酶切实验发现SsaL的N端loop区是其与分子伴侣SpiC-SsaM相互作用的关键界面。 4.SrcA是沙门氏菌SPI-2T3SS分泌的多种效应蛋白的分子伴侣。本研究通过细菌共表达体系对潜在的结合SrcA的效应蛋白进行筛选，发现只有SteD可以与SrcA形成稳定的复合物，而SseL、PipB2、SseK2等效应蛋白在大肠杆菌表达体系中不能与SrcA形成稳定的复合物。 本研究工作为理解双组分系统QseEF信号转导的机制以及SctV家族蛋白参与T3SS分泌过程的分子机制提供了实验基础，也为开发新型抗感染药物提供了理论支持。
沙门氏菌;双组分系统;Ⅲ型分泌系统;SctV家族蛋白;分子伴侣SrcA;耐药性
山东大学
硕士
微生物学
高翔
2022
中文
S852.61
2022-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）