还原伴侣蛋白调控细胞色素P450单加氧酶MycG催化功能的研究
细胞色素P450单加氧酶(CytochromeP450Monooxygeanses，CYP450s)是一类依赖血红素b的蛋白超家族，能够参与20多种不同类型的化学反应，例如羟基化、环氧化、脱烷基化和脱胺等。P450酶广泛参与天然产物和信号分子的生物合成、人体药物代谢以及异源物质的生物降解，被誉为“自然界中的万能催化剂”。氧化还原伴侣蛋白(简称还原伴侣，RedoxPaNner)对P450催化功能至关重要，负责将来自辅因子NAD(P)H的2个电子依次传递到亚铁血红素(Heme-iron)反应中心以激活氧分子来完成催化反应。在进化过程中P450与还原伴侣之间通过融合或分离方式演化出多种不同的催化系统。在P450酶功能重建过程中，还原伴侣与P450酶的适配性往往是造成P450酶催化性能重建失败或催化效率低的关键因素，同时也能够影响和改变P450酶的产物类型和分布。 不同还原伴侣与P450酶的组合，及其产生的差异性蛋白.蛋白相互作用是如何影响P450酶的催化功能、催化效率和产物分布是值得深入探究的科学问题。本研究以来自于稀有放线菌淡灰红小单孢菌(Micromonosporagriseorubida)产生的16元环大环内酯类抗生素麦新米星(Mycinamicin)生物合成途径中的多功能P450酶MycG(CYP107E1)和来自于红球菌(Rhodococcussp.NCIMB9784)的还原伴侣蛋白RhFRED为研究对象，构建了不同的融合和分离蛋白组合形式，系统研究了RhFRED与MycG的适配和相互作用模式对MycG功能、催化效率以及产物分布的影响。首先将RhFRED两个结构功能域拆解为两个独立蛋白FMN和Fe2S2，与P450酶MycG三者之间利用还原伴侣工程构建分离或融合型蛋白，通过体外生化反应比较不同组合方式下MycG对底物麦新米星Ⅳ(M-Ⅳ)的催化活性及电子传递效率。在构建的20个还原伴侣与P450酶的“非天然”催化组合中，16个组合能够成功重建MycG的催化功能，其中12个组合中MycG能够催化产生3种氧化产物麦新米星Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ(M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅴ)以及1种脱甲基产物dMe-M-Ⅳ;4个组合仅产生氧化产物M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅴ;剩余4个组合未检测到任何反应产物。 本研究通过模拟自然界中P450酶与还原伴侣系统共进化的不同形式，系统研究了还原伴侣与P450酶所构成的三种代表性催化系统(即:单、双、三组分系统)，以及单组分和双组分系统中不同的蛋白结构域的组织形式对MycG催化功能和性质的影响。结果表明不同还原伴侣系统与P450酶的组合/组织方式，能够通过蛋白一蛋白相互作用显著影响P450的催化功能、效率和性质。更重要的是，作为不同于传统的基于P450酶定向进化的蛋白工程策略，本研究利用还原伴侣工程策略构建“非天然”P450催化系统，是一种有效的P450酶工程策略，将有助于开发最佳的P450酶(及其还原伴侣)催化系统，实现特定的目标化学反应。
细胞色素P450酶;还原伴侣蛋白;MycG催化
山东大学
硕士
微生物学
张伟
2022
中文
Q55
2022-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）