冰岛硫化叶菌Ser/Thr蛋白激酶SisePK2在细胞周期中的调控作用研究
细胞周期发生在细胞增殖过程中，是一个十分普遍且重要的生命过程。真核生物具有十分明显的细胞周期，分为细胞第一次生长期G1期、DNA以及蛋白质合成的S期、细胞再次生长的G2期以及细胞分裂的M期。在真核生物中，细胞周期调控依赖于细胞周期检验点，其核心成分是周期蛋白(Cyclin)和周期蛋白依赖的蛋白激酶(Cyclindependentkinase，CDK)。具有明显细胞周期的生物不仅只存在于真核生物中，也存在于古菌中。古菌隶属于生命第三域，与真核生物具有较为接近的亲缘关系。古菌细胞周期以硫化叶菌研究的最为清楚，但是其调控细节仍不明确。硫化叶菌中含有多种蛋白激酶，这些蛋白激酶参与调控细胞内的各种生命活动，但是他们是否参与细胞周期调控未见报道。在本文中选用冰岛硫化叶菌REY15A为研究对象，探究蛋白激酶在细胞周期中的调控作用。 本文中的主要实验以及结果如下: 1、在冰岛硫化叶菌中具有典型蛋白激酶活性的蛋白质有九种，结合在冰岛硫化叶菌E233S同步化转录组数据分析，确定在冰岛硫化叶菌中SisePK2是唯一存在明显周期性变化的蛋白激酶，且SisePK2在G2期转录水平达到最高。随后，通过RT-qPCR确认了转录组数据结果。通过Westernblotting对细胞周期内不同时期SisePK2蛋白进行了定量分析，在同步化5h后，其蛋白水平达到最高。以上结果提示SisePK2可能参与细胞周期的磷酸化调控。 2、构建了ΔePK2菌株，分析发现ΔePK2在生长曲线、细胞形态上与对照E233S菌株无明显差异，并且该基因敲除不会引起细胞内细胞分裂蛋白表达的变化。但是通过乙酸处理对细胞周期同步化实验发现，ΔePK2在同步化后，观察不到明显的含单染色体细胞的峰，这说明SisePK2影响了细胞周期的进程，在乙酸处理后同步化至G2期后无法正常进入下一个细胞周期。 3、构建SisePK2过表达菌株Sis/pSeSD-ePK2以及SisePK2激酶活性位点突变体过表达菌株Sis/pSeSD-ePK2-K393A，Sis/pSeSD-ePK2D498A，Sis/pSeSD-ePK2D532A,Sis/pSeSD-ePK2K393AD498A,Sis/pSeSD-ePK2K393AD498AD532A。分析发现当SisePK2超表达时，细胞出现生长变慢、细胞变大，在Sis/pSeSD-ePK2中细胞直径接近正常细胞的两倍，这说明SisePK2过表达会抑制细胞分裂过程正常进行。流式细胞术分析显示在Sis/pSeSD-ePK2中，细胞内DNA含量增加，说明SisePK2过表达不影响细胞内DNA的合成。通过对Sis/pSeSD-ePK2进行细胞周期同步化后，细胞周期停滞在G2期。这说明SisePK2过表达影响了S期之后的G2期。在过表达激酶活性位点突变的SisePK2时，细胞大小基本恢复，但是细胞生长仍然很慢。依据SisePK2的结构域组成，针对其上的TPR基序以及激酶结构域构建了六个截短突变体，但是这些截短突变体均无明显表型，据此推测SisePK2的体内功能依赖于完整结构。 4、在冰岛硫化叶菌中纯化C端组氨酸标签SisePK2，对SisePK2及同时洗脱下来的蛋白进行质谱鉴定。发现蛋白酶体亚基SisPrmA可能是互作蛋白，并证明其能够被SisePK2磷酸化，但通过分子筛实验未发现两者之间能形成稳定的复合物。已有文献证明在硫化叶菌中蛋白酶体通过降解细胞分裂蛋白从而影响细胞周期。并且当在冰岛硫化叶菌中过表达模拟磷酸化的SisPrmA蛋白时，细胞生长变慢，说明SisPrmA可能是SisePK2对细胞周期的调控的磷酸化底物之一。 5、为了进一步探究SisePK2影响细胞周期的磷酸化底物，对E233S、AePK2以及Sis/pSeSD-ePK2进行同步化后0.5h、1.5h、2.5h的样品进行磷酸化水平检测，这三者之间的蛋白磷酸化水平存在明显的区别。通过磷酸化质谱鉴定存在磷酸化差异的蛋白，其中有两个转录因子SiRc_0263、SiRe_2067呈现明显的磷酸化的差异，推测可能是SisePK2潜在的磷酸化底物，但是其具体的调控作用仍需进一步探究。 总之，本研究鉴定了古菌冰岛硫化叶菌中一种参与到细胞周期调控中的激酶SisePK2，并确认了其在细胞周期中发挥功能的时期，寻找到了其潜在底物SisPrmA，另外发现两种可能参与到细胞周期调控中的转录因子SiRe_0263以及SiRe_2076。本研究为蛋白激酶在古菌细胞周期中的调控打下了基础。
冰岛硫化叶菌;细胞周期;蛋白激酶;SisePK2蛋白;转录水平
山东大学
硕士
微生物学
申玉龙
2022
中文
Q55
2022-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）