代谢工程改造解脂耶氏酵母生产5--氨基乙酰丙酸
5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinicadd，5-ALA)是卟啉途径的直接前体物。卟啉途径下游产物有血红素、叶绿素和维生素B12等物质。5-ALA具有独特的光敏性，在农业和医疗等领域应用广泛。与传统化学法相比，利用微生物发酵生产5-ALA绿色环保、可持续性强、反应温和。目前5-ALA的生物合成集中在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等细菌宿主中，表现出一定的工业生产前景。尽管如此，目前这些菌株仍然存在廉价底物利用效率低，5-ALA合成强度不足，以及对环境胁迫耐受性较差等限制，5-ALA的生产效率仍远未达到商业需求。为了打破技术瓶颈，必须探究新的平台微生物以及生物合成策略在5-ALA生产中的应用潜力。 非常规微生物具有独特的生理和代谢特性，在工业生物技术中发挥着关键作用，可能更适宜作为代谢工程宿主，以实现5-ALA工业化生产。解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica)是一种重要的非常规酵母，它具有底物利用谱广、对酸性条件的高耐受性以及安全性高等优点。在以经过基因编辑与代谢改造的微生物为底盘生产化合物技术的不断发展下，Y.lipolytica被构建成为生物燃料、有机酸、脂肪酸及其衍生物等的细胞工厂。作为一种严格的需氧和含油微生物，Y.lipolytica中具有较高的TCA循环代谢通量，它可以天然分泌众多TCA循环中间体。因此，对于以琥珀酰辅酶A为前体的5-ALA而言，Y.lipolytica声有可能是一个理想宿主。并且Y.lipolytica的酸碱耐受性强，在低pH条件下也能够正常进行生长和代谢活动，无需在发酵过程中添加酸碱调节剂，从而降低染菌风险，且有利于维持产物的稳定性。目前，还未有在Y.lipolytica中生产5-ALA的研究报道，本文计划在课题组前期构建的琥珀酸脱氣酶SDH缺陷型Y.lipolytica菌株中引入外源5-ALA合成相关基因实现5-ALA合成，并通过代谢途径改造、发酵优化等手段提高5-ALA产量，构建高效5-ALA合成菌株。首先，通过比较Y.lipolytica内源和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)来源5-ALA合酶基因过表达对5-ALA积累的影响，选择了来自S.cerevisiae的SchemI进行5-ALA合成;随后在不同SDH缺陷型Y.lipolytica中筛选出最适合5-ALA生产的菌株PGC62,并通过引入Saccharomycescerevisiae的SthemA和Escherichiacoli的EchemL,将C4和C5合成途径在Y.lipolytica中共表达，获得工程菌株PGC62-IAL;最终经过发酵条件优化，在分批补料发酵中首次实现了酵母为宿主的5-ALA高产，产量约为2216.8mg/L。 为了进一步提高产物的合成效率，本文对相关代谢途径进行了调控。由于三羧酸循环和5-ALA下游卟啉途径代谢能力较强，利用CRISPR干扰（CRISPRinterference，CRISPRi)技术对琥珀酰辅酶A合酶和5-ALA脱水酶编码基因的表达水平进行抑制并没有实现5-ALA产量提升。随后我们将改造策略集中在增强5-ALA生物合成途径的过量表达上。通过比较不同物种来源5-ALA合酶在Y.lipolytica的催化活性，筛选获得了5-ALA合成能力更强的Rhodopseudcmonaspalustris来源的RpahemO。采用非同源依赖的随机基因组整合方法，基于发酵液颜色筛选在PGC62菌株中实现该基因的表达增强。在摇瓶发酵中，RpahemO高表达整合菌株PGC62mcO的5-ALA产量达到了3541.8mg/L。为了进一步提高胞内5-ALA合酶活性，在PGC62mcO中过表达5''-磷酸吡眵醛激酶和5''-磷酸吡哆醛转运蛋白以增强辅因子供应。但是该方法并没有提高5-ALA产量。我们的研究表明，相比于上下游途径代谢调控，增强C4途径强度，是在Y.lipolytica中提高5-ALA合成效率和获得5-ALA高产菌株的最有效策略。
解脂耶氏酵母;5-氨基乙酰丙酸;代谢工程改造;酿酒酵母
山东大学
硕士
微生物学
祁庆生;夏永振
2022
中文
TS261.11
2022-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）