一种稳定表达长腹水蚤荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建和应用及重组毒株的序列分析
猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV)感染引起的传染病，给各国养猪业造成重大经济损失。PRRSV是变异最快的RNA病毒之一，自1995年在我国发现以来，在我国的流行范围不断扩大，并且形成了多种基因型和基因亚型并存的流行现状。近年来，疫苗毒株与野毒株重组以及不同谱系毒株间重组的情况屡见不鲜，给我国的PRRS防控带来了新的挑战。 基于其基因组的可塑性，猪繁殖与呼吸综合征病毒被开发为病毒载体，并被广泛用于表达外源基因，包括荧光蛋白基因、荧光素酶基因以及其它病原的保护性抗原等。本研究建立了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)TA-12毒株的反向遗传操作平台，并成功拯救到含有遗传标记的重组rTA-12M病毒。为了构建稳定表达分泌型长腹水蚤荧光素酶(Gaussialuciferase，Gluc)的PRRSV报告病毒，我们通过反向遗传操作将Gluc的表达框分别插入到TA-12M病毒基因组中的两个位点，nsp12/ORF2a和ORF7/3''UTR。通过细胞转染和病毒感染试验，成功拯救到ORF7/3''UTR之间含有Gluc插入的PRRSV报告病毒(rTA-Gluc2)。病毒生长曲线和空斑实验结果表明，报告病毒的生长特性与亲本病毒基本一致，尽管其滴度略低于亲本病毒。通过荧光素酶试验，在报告病毒感染后的细胞培养上清中检测到高水平的Gluc，并且Gluc的动态变化趋势与报告病毒滴度的变化趋势完全一致，说明病毒上清中的Gluc可以用于检测病毒的复制水平。荧光素酶试验和病毒基因组测序结果表明，报告病毒在MARC-145上连续传代10次后仍然稳定表达Gluc。基于该报告病毒良好的稳定性和Gluc检测的高灵敏性，我们将rTA-Gluc2用于筛选PRRSV特异性的抗病毒药物和PRRSV中和性抗体的检测。总之，本研究建立了HP-PRRSV的反向遗传操作系统，为深入解析其致病机制奠定基础;成功构建了稳定表达分泌型荧光素酶的PRRSV报告病毒，为PRRSV特异性抗病毒药物筛选和中和性抗体水平检测提供了快速高效的技术手段。 当前，我国主要的流行毒株分属于谱系1、谱系3、谱系5和谱系8，并且以谱系1和谱系8为主。国内广泛存在基因重组的毒株，尤以谱系1的类NADC30为亲本毒株最为普遍，给我国养猪业带来了新的挑战。类NADC30毒株极易与其他毒株发生重组，这也是造成我国目前毒株多样性的原因之一。本研究从病死的新生仔猪肺脏组织中分离到一株PRRSV病毒，并命名为JS2020。该病毒仅能感染猪肺泡巨噬细胞，不能感染传代细胞系MARC-145。JS2020的全长基因组由15016个碱基组成，与经典VR-2332毒株相比，其nsp2存在“111+1+19”氨基酸缺失，这与类NADC30毒株的特征一致。NCBIBlastN序列比对发现，与JS2020的相似度最高的毒株为15HEN1，相似度只有91.53％。重组分析表明，JS2020是类NADC30毒株和类NADC34毒株重组演化而来，病毒基因组的ORF2a-ORF6区域(11751nt～14231nt)来自类NADC34毒株，而其他基因组区域来自类NADC30毒株。因此，本研究分离到一株新型的重组PRRSV病毒，为深入了解当前PRRSV流行情况提供了依据。
猪繁殖与呼吸综合征病毒;重组毒株;长腹水蚤荧光素酶;序列分析
扬州大学
硕士
微生物学
李燕华
2022
中文
S858.28
2022-10-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）