鸡Toll样受体21单克隆抗体的研制及其初步应用
Toll样受体是一类Ⅰ型跨膜蛋白家族，是先天免疫系统中的关键组分之一，结构上的高度保守性决定了其可广泛识别细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体中特定的病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)，在机体抵御外界病原体感染的免疫防御机制中发挥重要作用。Toll样受体2l在哺乳动物中未发现同源性受体，为禽类和两栖类动物特有，有独特的生物学功能。目前，针对鸡Toll样受体2l(chickenToll-1ikereceptor21，chTLR21)的单克隆抗体的研制尚未见报道。本研究旨在制备抗chTLR21蛋白的单克隆抗体，为深入研究禽类TLR21的生物学特性提供支撑。 从GenBank中获知chTLR21基因序列开放阅读框长2919bp，编码972个氨基酸(aminoacid，aa)，由于chTLR21蛋白难以通过大肠杆菌原核表达系统表达，本研究选择以人工合成的chTLR21多肽作为免疫刺激原和酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)检测抗原。通过TMHMM、Bepipred两种软件预测其跨膜结构域和线性表位区域，最终选择该蛋白胞外结构域中线性表位免疫原性得分最高的一段序列——203CENNLTTLGPGPPLPASLLTLQL225作为本研究的多肽序列。由于多肽需要偶联相关载体蛋白才可以发挥免疫原性，故以该多肽chTLR21(203～205aa)偶联钥孑L血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)增强其免疫原性;以该多肽chTLR21(203～205aa)偶联牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)作为检测抗原包被酶标板。 选取6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，通过建立间接ELISA检测方法，确定最适抗原包被浓度为2.5μg/mL，取血清效价达1∶6400以上的阳性小鼠进行脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。通过间接ELISA筛选出阳性杂交瘤细胞株，同时，采用间接免疫荧光试验(indirectimmunofluorescentassay，IFA)检测chTLR21阳性细胞株的荧光反应性。经过3次亚克隆，获得4株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为1G3、2C10、386和4F11，单克隆抗体(以下简称单抗)亚类分别为IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2a型。其中，单抗386可与鸡细胞、组织中的chTLR21蛋白产生免疫印迹反应且具有较强的荧光反应性。制备单抗3B6、4F11腹水，其ELISA效价均高于1∶105。 利用激光共聚焦对chTLR21在鸡巨噬细胞(HD11)中的分布进行定位，确定chTLR21位于HD11细胞质中。通过qRT-PCR技术初步检测7日龄和35日龄SPF鸡各组织中chTLR21的分布情况，发现其在非免疫器官中胰腺、肝脏和盲肠表达量较高;在免疫器官中脾脏表达量最高。体外感染试验结果表明，禽致病性大肠杆菌(avianpathogenicEscherichiacoli，APEC)O1血清型E516菌株感染HD11细胞6～12h，chTLR21表达量显著增加，而LPS则无法激活chTLR21的表达;HD11细胞中，无论APEC感染，还是LPS刺激，均可使其白细胞介素(IL-1β)、干扰素(IFN-β)等细胞因子表达上调。在APECE516菌株、高致病性禽流感病毒(highlypathogenicavianinfluenzavirus，HPAIV)H5N6亚型毒株感染35日龄SPF鸡模型中，以基于单抗3B6的免疫印迹(Westernblot)和免疫组化(immunohistochemistry，IHC)方法检测感染鸡攻毒24h前后组织中chTLR21表达情况。结果显示APEC感染鸡肝、脾、肺、肾、法氏囊中chTLR2l表达量显著上升，而胰腺中表达量显著下降;HPAIVH5N6感染鸡上述组织中chTLR21的表达量均未见明显变化。本研究成功研制出针对chTLR21受体的单抗，单抗3B6可用于检测鸡体内chTLR21表达情况，适用于细菌、病毒感染时鸡细胞及组织中chTLR21表达水平的检测，并为chTLI也1在天然免疫应答中的机制、功能研究提供了重要的工具。
鸡;Toll样受体21;单克隆抗体;免疫组化
扬州大学
硕士
微生物学
高崧
2022
中文
S831
2022-10-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）