喜树碱类药物及干扰素--γ阻滞对噬血细胞综合征的疗效研究
第一部分喜树碱类药物对噬血细胞综合征小鼠模型的疗效研究 目的本研究旨在开发对噬血细胞综合征(HLH)治疗有效且无继发恶性肿瘤倾向的药物，改善HLH的长期预后。 方法1.体外药物筛选:分离小鼠脾脏和人外周血的淋巴细胞并进行活化，依托泊苷、拓扑替康、环磷酰胺、米托蒽醌、顺铂、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶等化疗药按浓度梯度稀释后分别作用于活化或静止的T细胞，流式细胞术检测药物诱导的淋巴细胞凋亡率，筛选出对活化的T淋巴细胞具有选择性凋亡诱导效应的药物。2.动物模型实验:(1)模型建立:所有小鼠腹腔注射淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，感染LCMV的野生型(WT)小鼠不发生HLH，感染LCMV的穿孔素基因敲除(Prf-/-)小鼠将发生HLH。(2)实验分5组:一组为阴性对照组，即野生型小鼠感染LCMV后仅予药物溶媒注射;二组为模型对照组，即Prf-/-小鼠感染后仅予药物溶媒注射;三个实验组，即Prf-/-小鼠感染后分别予依托泊苷、拓扑替康或伊立替康治疗。(3)疗效评价:酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠血清IFN-γ水平，疾病活动相关的生物标记包括血清可溶性CD25和血清铁蛋白水平，以及血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平;行血常规检测及脾脏组织苏木精-伊红(HE)染色病理检查;采用四聚体技术定量检测小鼠脾脏中LCMV特异的活化的T淋巴细胞;对各组小鼠的100天生存率进行比较，对小鼠的临床疾病严重程度进行评分。3.统计学分析:采用SPSS16.0软件，多组计量资料的比较采用方差分析或非参数检验，双侧P＜0.05有统计学意义。 结果1.体外药物试验结果显示，依托泊苷在1μM浓度时对活化的小鼠或人CD8+T淋巴细胞的杀伤比例均在50％左右，而对静止期CD8+T淋巴细胞的杀伤比例为6％左右。拓扑替康在0.03μM浓度时杀伤活化的CD8+T淋巴细胞比例已超过50％，而杀伤静止期细胞的比例仅为7％;拓扑替康在0.1μM浓度时杀伤活化的CD8+T淋巴细胞比例大于60％，而杀伤静止期细胞的比例仅为8％左右。以上结果表明，喜树碱类代表药物拓扑替康以剂量依赖模式选择性地诱导小鼠和人的效应T淋巴细胞的凋亡，效果与依托泊苷类似。2.动物实验结果显示:(1)拓扑替康、伊立替康和依托泊苷三个实验组小鼠的血清IFN-γ水平、血清可溶性CD25和血清铁蛋白(SF)水平及脾脏中LCMV特异的T淋巴细胞数与模型对照组相比均显著降低，而血红蛋白水平与模型对照组相比均显著升高(所有P＜0.05)。(2)拓扑替康治疗组小鼠第12天的血清ALT水平明显比伊立替康治疗组小鼠的血清ALT水平低(P=0.003)，而与依托泊苷治疗组小鼠的ALT水平相比，差异无统计学意义（P=0.70）。拓扑替康治疗组小鼠第12天的血清SF水平比伊立替康治疗组小鼠的SF水平低（P=0.01），而与依托泊苷治疗组小鼠的血清SF水平相比差异无统计学意义（P=0.99）。拓扑替康治疗组小鼠感染后第15天的中性粒细胞计数显著高于依托泊苷治疗组小鼠的中性粒细胞计数(P=0.046)。感染后第15天脾脏组织病理切片显示，拓扑替康治疗组小鼠的脾脏结构较其他治疗组小鼠的脾脏结构完整，炎症细胞浸润较少。(3)依托泊苷、拓扑替康和伊立替康治疗组小鼠100天生存率分别为75％、90％和90％，差异无统计学意义（P=0.37）。拓扑替康治疗组小鼠的疾病严重程度评分峰值显著低于依托泊苷治疗组小鼠的评分峰值（P=0.02），伊立替康和依托泊苷治疗组小鼠的疾病严重程度评分峰值差异无统计学意义(P=0.61)。 结论 1.喜树碱类代表药物拓扑替康在体内和体外都能显著地、选择性地诱导活化的T淋巴细胞凋亡，效果与依托泊苷类似; 2.拓扑替康对小鼠的噬血细胞综合征疗效稍优于依托泊苷，伊立替康对小鼠的噬血细胞综合征疗效与依托泊苷相近; 3.喜树碱类药物特别是拓扑替康对小鼠的噬血细胞综合征疗效显著，因其不具有诱发二次肿瘤的副作用，远期安全性优于依托泊苷，从而具有应用于临床治疗噬血细胞综合征的前景。 第二部分干扰素-γ受体及巨噬细胞失活对噬血细胞综合征小鼠的影响 目的本研究旨在初步探索干扰素-γ（IFN-γ）受体及巨噬细胞作为噬血细胞综合征治疗靶点的可行性。 方法根据小鼠的基因型分成4个组，每组6-8只小鼠，分别为野生型(WT)小鼠阴性对照组，单纯穿孔素基因敲除(Prf-/-)小鼠阳性对照组，穿孔素基因和IFN-γ受体基因双重敲除(Ifngr.PrfDKO)小鼠实验组以及体内巨噬细胞对IFN-γ不敏感的转基因的穿孔素基因敲除（MIIG.Prf-/-）小鼠实验组。用LCMV感染以上各组小鼠后不予其他干预，每周2-3次对小鼠进行HLH疾病严重程度的评分并记录生存情况，感染后第15天尾静脉取血进行血常规分析。统计学分析采用SPSS16.0软件，多组计量资料比较采用方差分析或非参数检验，双侧P＜0.05有统计学意义。 结果血常规结果示，Ifngr.PrfDKO小鼠与Prf-/-小鼠比较，血红蛋白和血小板的上升均有统计学意义（P=0.001和P＜0.001），中性粒细胞数的上升差异尚无统计学意义（P=0.07）;MIIG.Prf-/-小鼠与Prf-/-小鼠比较，血红蛋白（P=0.008）、血小板(P＜0.001)和中性粒细胞数（P＜0.001）的上升均有统计学意义。Prf-/-对照组小鼠感染LCMV后发生HLH，并于12-40天内全部死亡，而Ifngr.PrfDKO小鼠感染LCMV后疾病程度轻微，疾病过程和100天总体生存率(87.5％)与WT小鼠相仿。MIIG.Prf-/-小鼠感染LCMV后疾病程度重且无恢复倾向，100天总体生存率仅为16.7％。 结论IFN-γ受体的敲除能有效地阻断小鼠噬血细胞综合征的发展。抑制IFN-γ相关的巨噬细胞功能虽然能避免全血细胞减少的发生，但并不能有效地阻断噬血细胞综合征的发展。
儿童患者;噬血细胞综合征;喜树碱;干扰素--γ;穿孔素基因敲除;临床治疗
广西医科大学
博士
儿科学
罗建明
2016
中文
R725.5
2022-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）