肠组织ErbB4受体对菌群稳态的调控作用及机制研究
肠是人体最大的神经-内分泌器官，拥有数十万亿微生物组成的微生物群落。肠道微生物通过黏膜上皮细胞屏障、神经元免疫调控和细胞因子的相互作用参与正常肠道功能、机体神经调节以及拮抗病原微生物定植等诸多生理活动来维持肠道稳态。研究发现炎性肠病、肠易激综合征和抑郁症等均与肠道菌群稳态失衡相关，且它们能通过神经营养因子、神经递质等影响疾病的进程，说明肠道菌群的稳态对疾病发生发展有重要调控作用，但目前其作用机制尚不明晰。 肠黏膜上皮细胞表达EGFR等多种模式的识别受体，EGFR在胃肠道黏膜上皮炎症及肠道菌群的调控中有重要作用。EGFR所在的表皮生长因子受体家族有四个成员:EGFR(ErbB1)、ErbB2(Neu)、ErbB3和ErbB4。作为同一表皮生长因子家族的重要成员，ErbB4主要表达在大脑皮层的GABA能抑制性中间神经元，其功能表现在调控中枢神经系统、肿瘤发生及心脏增殖上。迄今为止，ErbB4在肠组织中的表达、分布及其作用尚不明晰;另一方面，ErbB4是否与肠道菌群有相互作用，目前尚不清楚。 目的： 因此，本研究以此为切入点，综合采用基因组学、形态学及分子生物学等手段，从ErbB4受体出发，从调控肠道的角度入手，阐明ErbB4受体在肠道菌群稳态中的作用，对疾病发生发展的影响，以期为相关疾病的病因研究及治疗新手段提供科学依据。 方法: (1)使用RT-PCR方法检测NRG1、ErbB4在C57BL/6小鼠肠组织中的表达情况; (2)使用多重标记免疫荧光染色法，检测NRG1、ErbB4蛋白在C57BL/6小鼠结肠内的空间分布表达情况，观察结肠中NRG1、ErbB4分别与中间神经元的空间表达关系; (3)进一步利用Vil1-Cre;Ai9品系转基因小鼠结肠组织，借助荧光标记的可视化方法，进一步检测ErbB4蛋白在Villin阳性上皮细胞的表达分布。 (4)利用Cre-Loxp介导的基因敲除策略，使用Vil1-Cre工具小鼠与ErbB4flox/flox小鼠杂交，制备条件性基因敲除Vil1-Cre;ErbB4-/-小鼠，采用基因鉴定、免疫组织化学、RT-PCR和Westernblotting实验等方法，分析ErbB4在小鼠结肠敲除效率及形态变化; (5)使用ErbB4+/-小鼠及其同窝小鼠对结肠菌群进行16SrDNA高通量测序，分析两组小鼠菌群多样性; (6)使用Vil1-Cre;ErbB4-/-小鼠及其同窝对照对结肠菌群进行16SrDNA高通量测序，分析两组小鼠菌群多样性; (7)使用Vil1-Cre;ErbB4-/-小鼠构建溃疡性结肠炎模型，分别在不同时间点收集小鼠结肠组织、结肠菌群，先后采用一般情况观察、RT-PCR实验、免疫组织化学等分析造模后小鼠外观、形态变化、mRNA及蛋白水平的表达;分别对Vil1-Cre;ErbB4-/-模型小鼠及其对照Vil1-Cre小鼠的结肠菌群进行16SrDNA高通量测序，分析菌群构成。 (8)使用C57BL/6小鼠构建溃疡性结肠炎模型，采用RT-PCR、Westernblotting实验分析ErbB4在炎性上皮急性损伤期及恢复期的表达变化情况。 结果: (1)NRG1-ErbB4信号通路分子在小鼠肠组织中广泛表达: RT-PCR结果显示，NRG1、ErbB4在正常小鼠胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠中广泛分布。 多重免疫荧光结果显示，NRG1在小鼠结肠黏膜固有层表达，与PGP9.5共表达于结肠黏膜层，在肠神经元有丰富表达;而ErbB4除了在肠神经元表达，还在结肠黏膜上皮层大量表达;ErbB4、ChAT、Tuj1在结肠黏膜固有层共表达;NRG1与ChAT、CGRP在中间神经元免疫定位于结肠黏膜固有层，与TH少量免疫定位于结肠黏膜下层。用Ai9工具小鼠进一步标记结肠黏膜上皮，发现在Villin阳性细胞中有ErbB4的丰富表达。 (2)ErbB4受体对小鼠肠道菌群稳态具有调控作用: 在ErbB4+/-小鼠肠道菌群中，norank-f-Muribaculaceae、Lachnospiraceae-NKA136-group、unclassified-f-Lachnospiracea和Akkermansia在ErbB4+/-小鼠群落构成中比例减小，Prevotellaceae-UCG-001、Helicobacter、Lactobacillus、Quinella和Alloprevotella在ErbB4+/-小鼠群落构成中比例增多。 在Vil1-Cre;ErbB4-/-小鼠肠道菌群中，norank-f-Muribaculaceae、Lachnospiraceae-NK4A136-group、Enterococcus、Dubosiella、Bacteroides、unclassified-f-Lachnospiraceae在Vil1-Cre;ErbB4-/-小鼠群落构成中比例减少，Lactobacillus、Odoribacter在Vil1-Cre;ErbB4-/-群落构成中比例增多。 进一步的菌群差异分析得出:norank-f-Muribaculaceae为共同差异菌群，差异比较中所占群落相对丰度差值均减少(p＜0.05)。 (3)ErbB4的缺失加剧溃疡性结肠炎病理发生进程: 在溃疡性结肠炎小鼠模型，ErbB4敲除后溃疡性小鼠炎症损伤加重;RT-PCR实验结果显示NRG1、ErbB4在模型mRNA水平有不同程度表达上调;Westernblotting检测结果显示了相同的趋势。 Vil1-cre溃疡性结肠炎模型急性损伤组(4dDSS)、恢复组（3dRecovery）与对照组相比，norank-f-Muribaculaceae菌群物种相对丰度(％)未见明显变化。但是Vil1-Cre;ErbB4-/-溃疡性结肠炎小鼠模型急性损伤组(4dDSS)与对照组相比，norank-f-Muribaculaceae菌群物种相对丰度(％)明显减小(p＜0.05)。 结论: (1)ErbB4通路分子在肠组织中广泛表达，ErbB4在Villin阳性细胞表达丰富; (2)ErbB4对肠道的菌群发挥调节作用，主要通过Villin阳性细胞参与肠道菌群稳态的调控; (3)ErbB4在溃疡性结肠炎发生发展中可能通过介导肠道炎症易感菌群norank-f-Muribaculaceae发挥调控作用。 综上，本研究揭示了ErbB4受体对肠道菌群变化的影响和表达规律，并揭示了ErbB4是影响肠道菌群稳态的一个关键性内源调控因素，其中Villin阳性结肠黏膜上皮细胞是潜在的主要细胞靶标和效应载体。研究揭示了周围神经系统中ErbB4信号系统通过肠道易感菌群norank-f-Muribaculaceae介导调控溃疡性结肠炎发展，是神经调控肠道菌群作用疾病的新机制。这些发现深化了我们对周围神经影响肠道菌群稳态的内在调控方式的认识和理解，为治疗相关疾病提供了分子学靶点和调控策略依据，也为探索神经-肠道调控分子机理提供了新的研究视角和科学依据。
肠疾病;ErbB4受体;菌群稳态
广西医科大学
博士
病原生物学
樊晓晖
2021
中文
R574.02
2022-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）