含深共熔溶剂体系中植物甾醇生物转化制备雄烯二酮的研究
甾体药物是全球市场上的第二大类药物，具有重要的医疗和经济价值，工业上可以通过雄烯二酮(AD)等重要中间体来制备。以分枝杆菌等微生物全细胞催化的植物甾醇侧链降解反应，是一种环境友好的AD生产方法，受到研究者的广泛关注。然而受限于底物的低水溶性、产物抑制和降解等问题，全细胞催化生产AD的产量仍较低，难以应用至大规模的工业生产中。深共熔溶剂(DESs)是近年来发展起来的新型绿色溶剂，在酶催化乃至全细胞转化领域都表现出了较好的效果，但对于分枝杆菌催化植物甾醇侧链降解这种复杂酶系催化的反应过程较少涉及。本文构建了含DESs的新型转化体系，用于分枝杆菌Mycobacterium sp.MB3683细胞催化植物甾醇侧链降解生产AD的过程，探讨了含DESs体系生物转化过程的作用机制，以提高AD的产量，推动绿色工艺的发展。 首先，合成了38种由不同氢键受体和氢键供体构成的DESs，研究了DESs的组成、亲疏水性、对植物甾醇溶解能力以及含DESs缓冲液缓冲性能等性质对转化过程的影响。结果表明含有机酸组分的DESs破坏了所用缓冲体系的缓冲能力，使细胞催化活性完全丧失。此外，以甜菜碱为氢键受体的DESs构成的转化体系的转化效率显著高于以氯化胆碱为氢键受体的DESs体系;以非葡萄糖的糖类为氢键供体的DESs体系的转化效率高于其他的DESs体系。高亲水性的DESs构成的转化体系具有更高的转化效率。其中，Bet/Mal(甜菜碱/麦芽糖，摩尔比4∶1)和Bet/Gal（甜菜碱/半乳糖，摩尔比5∶2）两种DESs具有良好的生物转化效果，相对缓冲液体系的AD得率分别可达131.9％和113.6％。 其次，在分枝杆菌静息细胞转化过程中，研究了DESs的种类和添加浓度对AD产量的影响，从细胞膜完整性、细胞形貌、细胞活力、AD积累与降解等角度出发，探讨了含DESs体系生物转化过程的作用机制。相比于甜菜碱基DESs，氯化胆碱基DESs对细胞膜完整性和细胞活力的损伤更大，不利于转化反应的进行。对于甜菜碱基DESs，适宜浓度即5-10％（体积比，下同）构成的转化体系有效维持了分枝杆菌细胞膜完整性，有利于保持稳定的胞内催化环境。该体系下，转化过程中AD降解物中间体雄二烯二酮(ADD)的浓度明显下降，意味着AD的降解途径被显著抑制，AD积累时间可延长至48h，从而保证了AD长期高效的积累。优化后在10％Bet/Gal体系中的AD产量提高至0.670g/L，相比于缓冲体系提高了38.9％。 最后，初步研究了含DESs体系中晶胶微球固定化分枝杆菌静息细胞转化生产AD的过程。选用甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸正丁酯聚合的晶胶微球为固定化基质，有效降低了静息细胞聚集导致的细胞活力损失，单位细胞的AD产量是悬浮培养静息细胞的6.8倍。在固定化细胞植物甾醇转化过程中，晶胶微球能够有效缓解DESs对细胞膜的损伤，并且DESs同样能通过抑制产物降解途径等机制提高AD产量。而在半连续转化过程中，由于降低了产物在晶胶微球内的积累量，在含10％Bet/Mal的转化体系中经过3批次生物转化后，单位细胞总AD产量可达到401.4mg/g DCW，相比于缓冲液中半连续转化（266.7mg/g DCW）和静息细胞悬浮培养转化(33.4mg/g DCW)均有显著的提高。 总之，DESs作为一种类似离子液体的绿色溶剂，兼具离子液体的可设计性、环境友好、不挥发、不可燃等优点且原料廉价、制备简单，在分枝杆菌降解植物甾醇侧链生产AD过程中具有明显的促进作用，展现了DESs在生物催化转化生产甾体药物中间体中潜在的应用前景。
雄烯二酮;植物甾醇;生物转化;分枝杆菌;深共熔溶剂;晶胶微球;固定化细胞
浙江大学
硕士
生物化工
关怡新
2021
中文
TQ464
2021-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）