基于结构的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2变构抑制剂的发现和活性评价
SHP2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族唯一被证实的原癌蛋白。PTPN1基因突变诱发的SHP2磷酸酶活性调控紊乱是RAS-RAF-MAPK，PI3K-AKT-mOTR，JAK-STAT和PD-1/PD-L1等致癌信号通路异常活化的病理基础。传统SHP2催化位点抑制剂的开发受到选择性和生物利用度的双重阻力而无法进入临床评价期。新型SHP2变构位点抑制剂的开发受阻于筛选平台的单一性和局限性，从而极大限制了变构抑制剂结构多样性的发展。因此本课题以SHP2独特的变构调控机制和物理化学特征为主导，建立并优化多重交叉的SHP2变构抑制剂高通量筛选平台，旨在结合药物化学研究发现具有新颖结构骨架和临床使用潜能的SHP2变构抑制剂，并从分子和细胞水平探讨其作用机理。具体内容如下: (1)重组融合蛋白SHP2的表达纯化和磷酸酶活性表征: 本课题运用大肠杆菌原核表达系统进行重组融合蛋白SHP2的体外表达和进一步的分离纯化，基于SDS-PAGE分子量表征的定性分析和DiFMUP磷酸酶活性表征的定量分析，表明其可用于后续抑制剂筛选工作。 (2)多重交叉高通量筛选体系的建立和广谱适用性: 本课题基于SHP2的酶促动力学和热稳定性特性，通过表征酶促反应速率和构象稳定性分别优化建立磷酸酶活性和热迁移高通量筛选平台。通过二者的交叉验证不仅能够表征苗头化合物的磷酸酶抑制活性IC50和结合强度Ki，而且能够有效区分催化位点抑制剂和变构位点抑制剂。本课题优化建立的动态测定法而非终点测定法能够有效排除化合物的荧光干扰。此外，该多重筛选体系也能够有效地拓展应用至临床常见疾病相关的SHP2突变体抑制剂的筛选。 (3)新型SHP2小分子的发现与作用机制研究: 本课题运用多重交叉高通量筛选平台对2595个结构新颖的小分子化合物进行高通量筛选，发现5个SHP2催化位点抑制剂(0.19％)和60个SHP2变构位点抑制剂(2.31％)。其中，苗头化合物TK-453是一个具有高潜能和高选择性的SHP2变构抑制剂，分子水平研究表明其具有可逆的和底物非竞争性的结合动力学特征。TK-453与SHP-099排他性地竞争结合在SHP2“隧道空腔”样的变构口袋。细胞水平研究表明TK-453也呈现较好的靶向性。TK-453以浓度和时间依赖性的方式抑制下游底物AKT的磷酸化水平，但对于肿瘤细胞KYSE-70，Hela和THP-1的增殖抑制活性较弱。 综上，本课题基于SHP2的酶促动力学和热稳定性建立的多重交叉高通量筛选平台具有良好的稳定性、可靠性和广谱适用性，为SHP2新型变构抑制剂的发现提供了科学有效的评价体系。此外，采用本方法高通量筛选发现的结构新颖的高潜能先导化合物TK-453也为SHP2临床药物的开发奠定了基础。
蛋白酪氨酸磷酸酶变构抑制剂;酶活性;高通量筛选;抗肿瘤活性
郑州大学
硕士
药物化学
余斌
2021
中文
R979.1
2021-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）