姜黄素纳米晶体联合胰岛素微针用于治疗Ⅰ型糖尿病的初步研究
研究目的:Ⅰ型糖尿病(T1DM)是一种慢性自身免疫性疾病，其具体发病机制尚不明确，但有研究表明在T1DM中，胰腺β细胞受到损伤，导致胰岛素(INS)分泌绝对不足，且有许多研究证实炎症细胞因子与氧化应激的级联可进一步损害胰腺β细胞，加剧高血糖。目前，T1DM的传统治疗主要是通过直接补充外源性INS控制高血糖症状，但该治疗方式需要多次皮下注射，导致患者顺应性差，且注射后存在感染风险，新兴治疗手段有通过胰岛移植或胰岛β细胞移植等间接补充INS，然而这些治疗方式存在供体缺乏、免疫排斥等弊端。因此，急需开发新的治疗策略，改善治疗弊端。本研究，拟以胰岛素-微针(INS-MN)经皮给药递送INS，维持血糖稳定，同时，姜黄素纳米晶体(CUR-NCs)通过口服途径给药作为T1DM辅助治疗的药物。最终以姜黄素辅助INS治疗发挥血糖稳态改善作用，探索其是否能够缓解甚至终止T1DM的进程。 研究方法:本研究首先用甲基丙烯酸酐(MA)接枝明胶(Gel)，形成明胶-甲基丙烯酸酐(Gel-MA)，分别通过紫外交联固化与核磁共振氢谱表征接枝是否成功。使用Gel-MA通过模具法制备负载INS的微针，并考察在制备中，离心温度、不同背衬层材料、Gel-MA浓度、干燥温度等条件对微针成形性、外观等影响;通过目视法、光学显微镜、扫描电镜对微针进行形态学考察;通过测定不同紫外照射时长下，微针产生相似位移所需力评价机械强度;通过皮肤恢复试验、台盼蓝染色以及H&E染色对微针刺入皮肤的情况及刺入深度进行评价;利用激光共聚焦显微镜对FITC标记的INS在微针针体内的分布进行考察。为缓解胰腺损伤，发挥更佳血糖稳定作用，本研究进一步制备了CUR-NCs。实验以泊洛沙姆188(F68)作为稳定剂，制备CUR-NCs，对CUR-NCs制备中的部分影响因素，如表面活性剂种类、探头超声振幅、探头超声时间、F68与姜黄素质量比等进行考察;CUR-NCs通过马尔文动态光散射粒度仪测定其水合粒径、多分散指数(PDI)以及Zeta电位，透射电镜观察其分散性以及表观形貌，紫外-可见分光光度法测定CUR-NCs中药物含量，X射线衍射仪(XRD)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)分别对CUR-NCs晶型以及结构变化进行评价。通过CCK-8法考察CUR-NCs与INS-MN的细胞毒性。最后，通过链脲佐菌素(STZ)诱导T1DM小鼠模型，连续给药40天，评价CUR-NCs与INS-MN联合作用对小鼠空腹血糖、体重以及小鼠临床症状的影响;在给药35天时，进行腹腔糖耐量试验，评价治疗后对小鼠糖耐量的改善作用;治疗结束后，评价小鼠甘油三酯与总胆固醇水平，通过H&E染色研究各组织病理学变化，进行安全性分析。 研究结果:本课题成功将MA接枝于Gel，在紫外灯(365 nm)照射下，固化作用明显，核磁共振氢谱计算峰面积之比得取代率高达63％;对形成的INS-MN微针进行评价，目视法和光学显微镜下可以看出针体呈圆锥体形，针体整齐排列，大小与模具相符，成型性较好，背衬层规整，无气泡断针等现象。扫描电镜观察，微针形态与光学显微镜结果一致，针体表面形成粗糙的网状结构，间接说明MA的成功接枝;机械性能实验表明，随着照射时长增加，微针形成更致密的网络结构，产生相似位移需要更大的力，改善了微针的机械性能;皮肤恢复试验、台盼蓝染色、H&E染色结果表明，形成的INS-MN可以成功刺入皮肤，刺入后几乎不会对皮肤造成损伤，且刺入有效深度可达～300μm;激光共聚焦显微镜结果表明，FITC标记的INS分布于整个针体，其中在针体前500μm处分布更为均一，相比于药物分布于整个针体，可减少药物的浪费。制备的CUR-NCs外观为橙黄色混悬液体，水合粒径为219.83±14.94nm，PDI为0.23±0.02;透射电镜下，CUR-NCs呈现棒状样结构，大小均一，分散性佳，无粘连等现象，长径为247.86±63.28nm;紫外-可见分光光度法测定结果表明，CUR-NCs中姜黄素实际含量为46.55±0.68％;XRD结果表明，在衍射角分别为14.121、25.774、26.788处，均存在姜黄素晶体峰;FTIR结果显示，CUR-NCs保留了姜黄素的特征峰碳碳双键与碳氧双键，说明制备为纳米晶体后，并未改变姜黄素化学结构。细胞毒性结果表明CUR-NCs在0-20μg/mL浓度范围内细胞存活率均高于85.5％，INS-MN在0-20μg/mL浓度内，细胞存活率均高于88.70％，说明二者在0-20μg/mL的范围内毒性较低，可用于后续研究。STZ多次诱导成功建立T1DM小鼠模型，并在连续给药40天后，CUR-NCs与INS-MN联合给药组，获得最佳治疗效果，小鼠血糖明显降低，体重也呈上升趋势，其余各治疗组，血糖也表现出不同水平的改善;腹腔糖耐量结果表明，CUR-NCs与INS-MN联合给药组小鼠血糖可以实现更快速的调节。血脂评价结果表明，CUR-NCs与INS-MN联合治疗组对T1DM脂质代谢紊乱有调节作用。H&E染色结果显示，除肝脏外，其余各组织均无明显损伤，而治疗组，尤其是INS与姜黄素联合治疗组肝损伤作用最小。 研究结论:综上实验结果，本研究成功制备了CUR-NCs与INS-MN。二者联合作用，在STZ诱导的T1DM小鼠模型中取得了较好的体内治疗效果，为T1DM的治疗提供了新的思路和策略。
Ⅰ型糖尿病;胰岛素;纳米晶体胰腺β;细胞姜黄素;微针胰岛素
郑州大学
硕士
药剂学
赵永星;侯琳
2021
中文
R587.1
2021-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）