酿酒酵母合成长叶烯的途径优化研究
长叶烯是一种由三个异戊二烯单元组成的三环倍半萜，常应用于香料产业，同时具有抗白蚁活性和体积燃烧热高的特点，因此有良好的应用前景。生物法合成长叶烯绿色、节能、可持续，具有重要研究意义。作为底盘细胞的酿酒酵母是一种成熟的真核表达系统，拥有内源甲羟戊酸(MVA)途径，适合进行异源酶的表达，具有合成萜类物质的巨大潜力。 本研究以酿酒酵母CENPK113-5D作为表达菌株，对挪威云杉、樟子松、台湾杉三种植物来源的长叶烯合酶基因lgfs、psTPS、TPS5进行筛选，并在酿酒酵母中建立长叶烯生物合成途径，最终确定psTPS为最适酶基因。 首先对酿酒酵母内源甲羟戊酸(MVA)途径进行代谢调控的研究，过表达四种关键限速酶基因—大肠杆菌来源的乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因(atoB)、法尼基焦磷酸合成酶基因(erg20)、异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi1)和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(thmg1)，并将其整合至酿酒酵母染色体中。然后，对酿酒酵母底盘菌株进行改造:包括敲除编码磷脂酸磷酸酶基因(dpp1和lpp1)、敲除负转录因子(rox1)以及下调角鲨烯合成的关键酶基因(erg9)的表达水平，从而对酿酒酵母内源竞争途径进行抑制。接下来，通过对七种内源分子伴侣的筛选确定了二硫键异构酶基因(PDI1)的过表达可以优化长叶烯合酶在酿酒酵母中的表达。最后，通过调控胞内乙酰辅酶A的合成途径进而促进长叶烯的生成，主要手段包括醇脱氢酶基因ADH1的敲除，醇脱氢酶基因ADH2、乙醛脱氢酶基因(ALD6)以及来源于肠沙门氏菌的乙酰辅酶A合成酶基因突变体(ACSL641P)的过表达。 综合上述策略最终构建了一株高产长叶烯的酿酒酵母菌株，在摇瓶水平下进行发酵，长叶烯的总产量达到27.30mg/L;5L发酵罐水平下进行分批补料发酵，长叶烯总产量达到165.96mg/L，是目前利用酿酒酵母作为底盘菌株，生物合成长叶烯所达到的最高产量。
长叶烯;酿酒酵母;MVA途径;底盘改造;分子伴侣;乙酰辅酶A
北京化工大学
硕士
生物工程
刘艳辉;巴利民
2021
中文
O629.61
2021-09-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）