基于病毒加帽酶构建酿酒酵母T7表达系统的研究
T7表达系统因其T7RNAP强大的转录活性和专一性，在原核生物中得到了广泛应用。目前T7系统在酵母细胞中并未建立成熟的表达体系，原因在于T7mRNA与真核生物的mRNA相比缺少转录后加工过程，尤其是缺少5'帽子结构。本研究采用酿酒酵母为宿主细胞，引入病毒加帽酶，将其加帽功能和T7系统的转录功能耦合，构建出独立于宿主表达系统之外的稳定T7表达系统。通过增加加帽酶种类、内含肽介导构建融合蛋白、改变T7转录效率等方式进行探索优化。本课题研究内容包括以下四部分: 1.初步构建基于游离VSV L蛋白的分离型酿酒酵母T7表达系统。将携带有口炎疱疹病毒VSV L蛋白基因和T7启动子特定设计后引导EGFP转录的自主复制型质粒转入基因组整合T7RNAP的酿酒酵母菌株中，初步建立VSV L蛋白和T7RNAP分离的分离型T7表达系统。结果显示未检测到荧光信号，原因可能为T7RNAP与加帽酶的空间阻隔致使功能耦合度低或者VSV L蛋白加帽酶活性低。 2.构建酿酒酵母Npu DnaE蛋白自组装系统。为消除T7RNAP与加帽酶之间的空间阻隔，构建T7RNAP-加帽酶的融合蛋白。引入内含肽Npu DnaE，并在酿酒酵母中构建了Npu DnaE介导的蛋白组装体系，以分离的EGFP为组装对象，实验结果显示Npu DnaE介导分离EGFP的组装效率为20％。 3.通过增加加帽酶种类、内含肽介导构建融合蛋白、改变T7转录效率等方式进行酿酒酵母T7表达系统的优化探索。引入呼吸道合胞病毒RSV L蛋白、乳酸克鲁维酵母线性质粒pKGL2ORF3蛋白及非洲猪瘟病毒ASFV NP868R蛋白，以更灵敏的Nanoluc萤光素酶基因做为报告基因，建立了基于四种加帽酶的分离型T7表达系统，结果显示ASFV NP868R所在系统的表达水平是VSV L蛋白的10倍左右;然后引入Npu DnaE，介导T7RNAP与病毒加帽酶形成融合蛋白，构建融合型T7表达系统。实验结果显示融合型T7系统与分离型T7系统的表达水平无明显差异;之后将特定设计的T7启动子恢复为完整的T7启动子，表达水平依然没有明显的差异。通过传代实验，证明了基于病毒加帽酶的T7表达系统可以在酿酒酵母中稳定存在。最后将ASFV NP868R所在系统与酿酒酵母表达系统进行比较，发现ASFV NP868R所在的分离型T7表达系统的表达水平仅为半乳糖启动子的1/10左右。 4.酿酒酵母T7系统的转录效率分析。以EGFP为转录目标，对酿酒酵母中的甲硫氨酸启动子、半乳糖启动子、T7启动子、T7启动子（删除+1至+3位G）进行转录效率的分析，发现酿酒酵母中T7转录效率与甲硫氨酸启动子相当而且T7启动子删除+1至+3位的G后，转录效率降低10倍左右。半乳糖启动子的转录水平是T7转录效率的6.5倍。对于游离NP868R的酿酒酵母T7系统进行转录水平分析，也证实了酿酒酵母中T7RNAP的转录效率是影响表达水平的关键因素。 本文利用病毒加帽酶，首次在酿酒酵母中建立了可以稳定存在的T7表达系统并测定了酿酒酵母T7表达系统的转录水平，为T7系统在酿酒酵母蛋白表达和代谢调控的深入应用开创了道路。
T7表达系统;酵母细胞;病毒加帽酶;转录效率
北京化工大学
硕士
生物工程
王文雅;赵伟
2021
中文
Q786
2021-09-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）