新型甲氧苄啶耐药基因的鉴定、耐药机制及泛耐药菌的耐药性研究
抗生素使用与细菌耐药性增长的问题已成为21世纪人类在医药健康领域亟待解决的问题之一。于20世纪60年代初期合成并投入临床应用的甲氧苄啶(TMP)，作为细菌二氢叶酸还原酶(DHFR)的竞争性抑制剂，通过阻止二氢叶酸还原为四氢叶酸，干扰细菌叶酸代谢达到抑制细菌生长的目的。四氢叶酸是细菌体内重要的一碳单位，参与DNA、RNA和某些氨基酸的合成。因为细菌不能利用体外四氢叶酸，二氢叶酸还原酶的还原是四氢叶酸从头合成的必要步骤，因此甲氧苄啶等抗叶酸药物对原生生物以及细菌作用的靶向性好，对宿主影响较小。但同其他抗生素一样，由于甲氧苄啶在医疗卫生和畜牧养殖业中的长期和过度使用，临床甚至自然环境中发现的甲氧苄啶耐药细菌的数量和比例逐渐增加，编码甲氧苄啶耐药二氢叶酸还原酶的dfr基因数量已达四十余种。dfr耐药基因常常与整合子、质粒等可移动遗传元件相关联，这对于耐药基因的转移、扩散以及多重耐药、泛耐药甚至全耐药菌株的形成提供了便利和可能。因此分离鉴定临床或环境中的新型dfr基因及其遗传结构对于判断甲氧苄啶耐药的分子遗传机制以及扩散转移风险有现实意义。本文按照基因-蛋白-结构的思路对甲氧苄啶耐药的二氢叶酸还原酶进行系统性分析，探究新型二氢叶酸还原酶对甲氧苄啶耐药的具体机制，为新药开发以及临床上甲氧苄啶高水平耐药的消减提供策略支持和研究方向。 水环境因其在生物圈中独特的地位，已成为了耐药基因和耐药菌发展和传播的绝佳场所，其中蕴藏了大量新型基因和新的耐药基因组合。本实验室前期工作已从水环境中发现了四种新型dfr基因，一种来源于嗜水气生单胞菌，三种来源于变形杆菌属，都是能够引起水生生物或人畜患病的条件致病菌。经过一系列的生物信息学和生化结构分析，对四种新型dfr基因进行了从基因型到表型到功能结构的系统性研究并提出有关甲氧苄啶耐药机制的科学问题。此外，本文还对临床粪便样本中分离得到的一株包括甲氧苄啶在内的泛耐药肺炎克雷伯菌的耐药性和遗传结构进行了研究。具体研究内容及实验结论如下: 1、四种新型dfr基因介导对甲氧苄啶和复方新诺明的高耐药表型。 根据美国CLSI药敏实验标准推荐的微量肉汤稀释法，测定携带dfr基因的原始菌株ProteusvulgarisLK4，ProteuspenneriLTe9，ProteusvulgarisLK8和AeromonashydrophilaSam7-TMC1对甲氧苄啶和复方新诺明的最小抑菌浓度(MIC)。原始菌株表现出对甲氧苄啶(MIC≥1024mg/L)和复方新诺明(MIC≥64/1216mg/L)的高耐药表型。为验证新型dfr基因的作用，使用GB/dir同源重组的方法将四种dfr基因分别从原菌株中克隆并连接到pACYC184质粒的catI基因下游(共用catI基因的启动子)，重组质粒转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞。统一启动子表达水平及菌株的遗传背景后，测定含有dfr基因的转化菌株对甲氧苄啶和复方新诺明的最小抑菌浓度，转化菌株也表现出类似的高耐药性。通过原始菌株及构建的重组质粒转化株的药敏实验，可以得出甲氧苄啶的高耐药表型是由新型dfr基因介导的结论。 2、通过序列比对及系统进化树分析，三个复杂1型整合子中发现的dfr基因编码新型A家族DHFRs，1型整合子中携带的dfrB7基因编码B家族第七个DHFR。 测序分析新型dfr基因的遗传结构，这三个dfr基因分别位于复杂1型整合子的ISCR1元件下游，整合子携带三种不同的耐药基因阵列。使用MAGE7.0软件，将新型dfr基因编码的蛋白序列与已知的TMP耐药DHFRs一起进行系统发育分析，发现来源于ProteusvulgarisLK4，ProteuspenneriLTe9和ProteusvulgarisLK8的三个dfr基因编码与A家族DHFRs共聚的新型蛋白，并照规则分别命名为DfrA42、DfrA43、DfrA44。另外，进化树的聚类结果也验证了AeromonashydrophilaSam7-TMC11型整合子中发现的dfrB7基因编码B家族的DfrB7。 3、体外酶活实验表明，相比染色体上敏感型DHFR，A家族耐药DHFRs的酶学相关参数差异不大，B家族DHFRs的酶活催化效率显著降低，因此酶的催化活性提高不是导致TMP耐药的原因。 使用大肠杆菌T7表达系统(pET15b(+)质粒)对四种新型TMP耐药DHFRs、A、B家族代表性的DfrA1、DfrB1以及大肠杆菌DH5α染色体上folA基因编码的EcDHFR进行异源表达和纯化。纯化的蛋白分别进行NADPH:二氢叶酸(DHF)的氧化还原酶活测定，通过非线性回归分析拟合不同DHF浓度下A340吸光度的衰减率，根据米氏方程计算出酶学相关参数。A家族耐TMP的DfrA1、三种新型DHFRs与敏感型EcDHFR在催化效率(kcat)和底物亲和力(Km)上没有明显区别。B家族的DfrB1、DfrB7相比EcDHFR，底物亲和力相近，但转化数(kcat)有200-400倍的降低，导致催化效率(kcat/Km)的显著降低。因此，不能得出TMP耐药性是由于耐药DHFRs的酶活性或催化效率高的结论。 4、对新型DHFRs的甲氧苄啶耐药机制提出三种假设:一是由强启动子等引起DHFRs的过表达，消减了TMP的抑制作用;二是耐药DHFRs表现更高的催化活性，少量酶即可维持细胞代谢所需;三是抑制剂TMP与耐药DHFRs的结合受限，无法进行竞争性抑制。研究发现TMP与新型DHFRs的亲和力降低更有可能是耐药原因。 使用等温滴定量热仪PEAQ-ITC进行常温298K下的等温滴定量热(ITC)实验，比较TMP对耐药DHFRs和敏感的EcDHFR结合力的大小。未检测到B家族DfrB1、DfrB7与TMP的结合。相比敏感的EcDHFR，TMP对A家族的三种新型耐药DHFRs的平衡解离常数KD值显著降低了10-40倍。因此，尽管A、B家族耐药DHFRs存在显著差异但都对TMP表现低亲和力的特性。通过以上实验结果，推测A、B家族DHFRs通过第三种假设，即显著降低与TMP的结合或者完全不与之结合的方式实现耐药性。 5、筛选优化二元复合物DfrA44·NADPH、DfrA44·TMP和三元复合物DfrA44·NADPH·TMP的蛋白晶体，X射线衍射后收集并解析DfrA44的晶体结构，DfrA44是一个包含6个α螺旋和8个平行或反平行β折叠的典型的罗斯曼折叠结构。 使用CrystalscreenKit、PEGRxscreenKit、PEG/lonKit晶体筛选试剂盒，通过悬滴法在晶体筛选板上进行筛选和优化，获得合格晶体后进行X射线衍射，收集数据并进行结构的解析和修正。分析DfrA44·TMP二元复合物和DfrA44·NADPH·TMP三元复合物的结构，发现TMP与DfrA44的相互作用主要由结合腔底部的氢键网络、中部的疏水作用以及开口处弱的氢键作用三部分以及π-π相互作用等组成。比较发现NADPH对DfrA44的整体结构以及TMP结合DfrA44的影响不大，但NADPH的结合会使底物结合通道的开口缩短2.9(A)，TMP上苯环2-甲氧基团发生反转。因为P52与TMP的2-甲氧基团距离急剧缩小(从4.9(A)到1.9(A))，强烈的空间位阻效应导致TMP苯环上2-甲氧基团发生了反转以增加3(A)的距离。 6、TMP结合通道入口处结构的变化可能是DfrA44对TMP耐药的原因。 DfrA44·NADPH·TMP三元复合物结构分别与已报道的TMP敏感和耐药DHFRs结构进行比较后发现，各DHFRs中TMP结合方式相似性很高，DfrA44与TMP敏感型DHFRs的不同似乎在TMP结合入口处。DfrA44的TMP入口表现得更小更疏水。由此推论DHFRs底物结合通道入口的大小和疏水性强弱可能是TMP耐药的重要原因。但这一假设需要进一步的实验数据支持。 7、从结肠癌病人粪便样品中分离到一株对包括甲氧苄啶在内抗生素的泛耐药肺炎克雷伯菌，命名为Klebsiellapneumoniae2-1。全基因组测序鉴定出携带两个环形质粒，通过对遗传结构和耐药分子机制的研究，该菌株的泛耐药表型是由携带的两个多重耐药质粒上的耐药基因造成。 分离于结肠癌病人粪便样本的K.pneumoniae2-1菌株对除第四代头孢菌素头孢吡肟、“最后一道防线”之称的替加环素和新增的头孢他啶-阿维巴坦联合抑制剂外的所有抗生素均有耐药性。通过全基因组测序，确定K.pneumoniae2-1菌株中含有一个5.23Mb的染色体和两个大小分别为246kb和90kb的环形质粒。基于复制子序列类型和PlasmidFinder数据库确定两个质粒分属IncHI1B和IncA/C2家族。通过相似质粒的基因比较及接合转移实验结果，确定较大的pKP21HI1质粒是一个接合转接缺陷型质粒，属于不相容质粒HI1B类群的一个新序列类型。比较基因组学分析和抗生素耐药基因分析表明，虽然K.pneumoniae2-1的染色体序列与参考菌株K.pneumoniaeHS11286基因组相比发生了大量变化，但均不涉及耐药性，因此K.pneumoniae2-1的泛耐药表型主要是由于两个多重耐药质粒的存在。本研究揭示了对现有抗生素表现泛耐药的K.pneumoniae2-1的遗传基础和耐药机制，并发现质粒在细菌的强耐药表型中起到关键作用。 综上所述，对环境和临床样本中分离和发现的新型耐药基因和强耐药表型菌株的研究对于已有耐药基因库的丰富和抗生素耐药现状与前景的分析具有十分重要的意义。通过一系列生化实验，对甲氧苄啶耐药细菌中四种新型dfr耐药基因进行了鉴定、分类、表达纯化、二氢叶酸还原酶酶活力测定、甲氧苄啶结合力检测等系统性研究并从生化和结构角度探究了甲氧苄啶耐药的具体机制。结果表明，甲氧苄啶耐药机制可能受包括NADPH、TMP结合位点或特殊功能区等多个残基的影响，推论耐药二氢叶酸还原酶的甲氧苄啶结合位点处氨基酸发生突变，使得甲氧苄啶的亲和力降低，减弱了对二氢叶酸还原酶的抑制作用。此外，分离鉴定了临床样本中甲氧苄啶耐药的K.pneumoniae2-1，并对其泛耐药表型进行了遗传结构和分子机制研究，得出多重耐药质粒上丰富的耐药基因导致菌株泛耐药表型的结论，并提出可以通过消减和控制多重耐药质粒实现阻碍强耐药性菌株出现的应对策略。
甲氧苄啶;耐药性;二氢叶酸还原酶;耐药基因;耐药机制
山东大学
博士
微生物学
徐海;王明钰
2021
中文
R978
2021-08-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）