基于纳米多孔金的病原微生物电化学检测方法研究
传染性疾病是由病原微生物如真菌、细菌、病毒、类病毒等引起的全球性问题，不仅造成严重的人员伤亡，而且会导致巨大的经济损失。对于病原微生物的快速识别和检测在医学检测和治疗以及食品安全检测等领域具有重要意义。电化学传感器具有微型化、构造灵活以及成本廉价等特点，在许多要求高灵敏度、操作简单、响应时间快和成本低的领域中非常具有吸引力。在过去的十几年中，由于生物科学以及材料科学的快速发展，开发出了多种生物标志物、酶、抗体以及大量具有良好导电性和/或催化活性的纳米材料和复合材料等物质，这使得电化学传感器的种类、检测限、灵敏度和特异性等都有了极大的提高。电化学传感器凭借这些优势在病原微生物检测领域潜力巨大，被广泛认为是比传统病原微生物检测方法更便宜、更有效的替代方法。纳米多孔金(Nanoporous gold，NPG)具有比表面积大、导电性好、高生物相容性以及对多种物质具有催化活性等优势，是一种理想的电化学传感器的构建材料。本研究选择乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)、Listeriamonocytogenes等病原微生物作为模型，针对不同病原微生物的生物标志物选取合适的生物识别元件，结合NPG的优异特性，构建不同类型电化学传感器并对其检测性能进行了详细研究，挖掘基于NPG的电化学传感器在病原微生物检测领域的应用价值。具体研究内容以及结果如下: 1.基于NPG/HRP共催化的免疫传感器构建及其对HBeAg检测研究 乙肝e抗原(Hepatitis B e antigen，HBeAg)是HBV感染疾病的一种重要血清标志物。因此，对HBeAg的检测至关重要。具有连续三维纳米多孔结构的NPG是固定生物识别元件的一种理想的支持材料，可以用于固定多种类型的生物识别元件。此外，NPG作为纳米多孔金属材料，具有出色的导电性，并且对许多底物(例如邻苯二酚等)具有高效的催化活性。本章选取NPG作为固定化载体，基于辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)和NPG共同催化作用的信号放大策略来构建检测HBeAg的电化学免疫传感器。基于HRP与NPG共催化作用的信号放大策略，本研究构建的免疫传感器在峰电流密度与HBeAg浓度之间展现出良好的线性关系。对于HBeAg检测的线性范围为1pgmL-1～1ngmL-1，灵敏度为23.51μAmLng-1cm-2，检测限为0.064pgmL-1。抗干扰性实验证实本研究所构建的免疫传感器具有优异的选择性和较强的抗干扰性。此外，该免疫传感器在存储一周后仍具有95％的电信号响应。在实际应用中，利用加标回收的方法使用该免疫传感器成功实现了人血清中HBeAg的检测。基于以上优异的性能，该免疫传感器在临床中对于HBeAg的检测有较强的应用潜力。同时，基于酶和纳米材料共催化的信号放大策略可以为其他研究人员在免疫传感器的构建中提供新思路。 2.脂质体传感器的构建及其对产CDCs毒素病原微生物的检测研究 胆固醇依赖细胞溶素(Cholesterol-dependent cytolysins，CDCs)是一种成孔毒素，通常被认为是一些革兰氏阳性病原菌的致病因素。当病原菌侵入宿主细胞后，病原菌产生的CDCs可以与识别细胞膜上的胆固醇从而锚定在宿主细胞膜上，随后CDCs单体之间相互结合，在细胞膜表面形成孔道帮助病原菌从细胞内逃逸并在宿主内扩散。因此，可以通过检测CDCs实现对产CDCs毒素病原微生物的检测。 本章利用CDCs成孔能力，构建脂质体生物传感器。其检测原理为:利用CDCs的成孔能力破坏负载于NPG表面的人造脂质体，引起脂质体内含物-邻苯二酚的释放，释放出的邻苯二酚可以被NPG催化氧化产生电信号，且电信号强度与CDCs浓度呈正相关。为了探究该脂质体生物传感器的传感能力，选择CDCs家族比较具有代表性的ListeriolysinO(LLO)蛋白、α-hemolysin(ALN)蛋白以及cereolysinO(CLO)蛋白作为待测目标。以L.monocytogenes、StaphylococcusaureusATCC6538以及Bacillusanthracis基因组DNA为模板，分别在EscherichiacoliBL21(DE3)中表达上述三种蛋白并纯化。结果表明，该脂质体传感器可以对CDCs蛋白家族中的LLO、ALN以及CLO三种蛋白进行灵敏性响应，检测范围分别为0.5～12.0μgmL-1、0.5～8.0μgmL-1以及1.0～10.0μgmL-1。同时，选择L.monocytogenes为实际样品检测模型，探究所构建的脂质体生物传感器对产CDCs蛋白家族菌的实际检测能力。结果证明该脂质体生物传感器对产CDCs蛋白的菌量的检测结果与平板计数法相符，且对于不产CDCs的菌具有良好的抗干扰性。基于以上优异性能，该脂质体传感器在产CDCs的革兰氏阳性致病菌的检测方面有较强的应用潜力。 3.同时检测L.monocytogenes标志基因hly和iap的生物传感嚣构建研究 李斯特菌病是一种由摄入受L.monocytogenes污染的食物引起的疾病，会影响免疫功能低下的患者、孕妇和新生儿。在摄入污染的食物后，L.monocytogenes会穿过肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障，引起胃肠炎、脑膜炎、流产、妊娠并发症等，严重危害人类健康。因此，可靠、灵敏、准确地检测食品中的L.monocytogenes对预防感染具有重要意义。通过检测某一个标志基因来鉴定L.monocytogenes是传统检测方法中常用的鉴定方式，但是基于单一标志基因的检测易出现假阳性等问题，且传统分子生物学检测方法所用仪器设备较为昂贵，操作复杂。 本章选取hly和iap两个标志基因作为待测的目的基因，以分别与hly和iap互补的巯基化捕获探针作为识别元件，NPG作为识别元件的固定化载体，构建hly-iap核酸生物传感器。具体检测原理如下:靶基因hly和iap可以与固定在电极表面的捕获探针通过碱基互补配对方式相结合。随后，携带有不同信号标签的信号探针与对应的靶基因hly或者iap相结合。其中，用于检测hly基因的信号探针上携带有电活性标签-亚甲基蓝(Methylene blue，MB)，通过检测MB所产生的电化学信号实现对hly基因的检测;HRP通过生物素-链霉亲和素相互作用与iap信号探针结合得到HRP-iap信号探针，通过检测HRP催化底物H2O2所产生的电信号实现对iap基因的检测。所构建的hly-iap核酸生物传感器对L.monocytogenes的检测范围为1.0×104～1.0×108CFUmL-1，同时对于多种菌具有良好的抗干扰性，并实现了对实际样品中L.monocytogenes的可靠性检测。同时检测hly和iap两个标志基因可以避免检测单一基因可能出现的检测结果不准确或假阳性等情况。此外，通过检测两种基因得到的结果可以相互印证，增强了检测结果的可靠性。这些优异特性使得该hly-iap核酸生物传感器在L.monocytogenes检测方面具有一定的应用潜力。 4.基于不同水平标志物的L.monocytogenes三功能试纸条型传感器构建研究 本章从核酸水平、小分子代谢物水平分以及蛋白水平分别选择不同的标志物(hly基因、乙偶姻以及LLO蛋白)构建了一个三功能试纸条型传感器实现对L.monocytogenes的检测。选择对多种底物(比如NADH)具有催化作用的NPG作为固定化载体。具体检测原理如下:根据hly基因序列设计合成的巯基化的捕获探针通过Au-S键固定于NPG表面，靶基因hly可以与捕获探针通过碱基互补配对方式相结合。MB作为一种电活性标签，可以插入到双链结构中两个连续的碱基对中，然后产生可以被检测到的电化学信号。此外，有文献报道乙偶姻可以作为检测L.monocytogenes的生物标志物，且乙偶姻浓度与L.monocytogenes浓度呈正相关。对于乙偶姻的检测，当存在有辅因子NADH时，乙偶姻还原酶(Acetoin reductase，AR)可以将乙偶姻还原为2，3-丁二醇。结合上述NPG对NADH的电化学催化作用，可以通过检测反应体系中NADH的消耗量，实现对乙偶姻的定量检测。因此，L.monocytogenes的浓度可以由乙偶姻量与L.monocytogenes浓度之间的线性关系间接计算得到。对于LLO蛋白的检测，选择包含有邻苯二酚的脂质体作为识别元件，利用LLO蛋白在脂质体表面的成孔能力对其进行检测。基于上述检测原理，本章首先利用普通三电极体系评估了检测hly基因和乙偶姻的可行性，并对该传感器的电化学行为、L.monocytogenes的检测性能进行了探究。在此基础上，利用具有四个工作电极的一次性试纸条构建了三功能试纸条型传感器，进一步优化该传感器的便携性，并将该试纸条型传感器对实际样品检测结果与Real-timePCR(qPCR)结果进行了比较，进一步探究了该试纸条型传感器对L.monocytogenes检测的实际应用潜力。结果证明所构建的三功能试纸条型传感器对于L.monocytogenes具有1.0×104～1.0×109CFUmL-1的较宽的线性范围。同时，该三功能试纸条型传感器对于hly和乙偶姻具有较好的选择性检测能力，对于LLO蛋白具有一定的选择性检测能力，并实现了对实际样品中L.monocytogenes的可靠性检测。与L.monocytogenes国标鉴定方法GB4789.30-2016相比，所构建的三功能试纸条型传感器具有以下优点:1)虽然需要预富集过程，但是对于L.monocytogenes不同层面标志物的简单检测过程取代了国标方法中复杂的鉴定过程(比如动力学试验、过氧化氢酶试验、糖发酵、溶血特性等);2)对不同层面标志物的检测不仅保证了L.monocytogenes鉴定结果的可靠性，而且将GB4789.30-2016方法中2～5天的鉴定时间缩短到了2h左右。与基于核酸水平标志物检测的qPCR方法相比，构建的三功能试纸条型传感器不仅表现出相似的检测性能，而且通过检测不同水平的标志物，降低了基于单一水平标志物检测的假阳性的概率。此外，构建的三功能生物传感器所需的预富集过程为消除L.monocytogenes鉴定中的假阴性情况提供了保证。这些独特的性质使得该三功能试纸条型传感器成为检测L.monocytogenes的良好选择。
纳米多孔金;病原微生物;电化学检测
山东大学
博士
微生物学
王霞
2021
中文
R446.5;O657.1
2021-08-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）