微纳米结构介导的不同物理信号对干细胞命运的调控研究
组织工程是一门细胞生物学和材料科学相结合的学科，对修复组织和器官损伤具有重要的意义。一般认为其包括三个要素:种子细胞、支架材料和生长信息。基于以上三个要素，组织工程的主要研究内容包括:对细胞进行有效的体外扩增以获得充足的细胞尤其是干细胞，设计和构建合理的细胞培养支架，提供有效的生长信息指导干细胞的增殖和分化等行为。组织重建是一个复杂的动态的生理过程，以骨组织工程为例，骨重建包括骨、神经、血管等组织的再生，在细胞层面要求干细胞向骨细胞、神经细胞等功能细胞的分化。在细胞生物学研究中，生物和化学分子多被用来调控干细胞的增殖和分化等行为，但是存在定域性不强、易扩散和价格昂贵等缺点。而微纳米材料介导的结构信号和电信号等不同的物理信号，对干细胞命运的调控具有定域性强和安全高效等显著优点，因此使用支架材料对负载的干细胞实现不同功能细胞分化将是组织工程的有效途径。本论文根据组织工程研究中对不同物理信号的需求，制备了不同结构及性质的细胞培养支架用于干细胞扩增及干细胞分化的调控，对微纳米结构介导的不同物理信号对于细胞命运的调控作用进行了研究。 本论文的研究主要从以下几个方面展开: 1.纳米微结构复合材料对干细胞扩增和表型维持性的研究:干细胞是用组织工程手段修复各种组织和器官的基本要素。然而，缺乏充足的干细胞源仍是限制组织工程和临床医学进一步发展亟待解决的重要问题。传统的使用细胞培养皿的二维培养方法存在培养环境与体内微环境相差较大以及细胞取用不方便等缺点。基于支架材料的三维培养可以为细胞提供与体内相近的微环境，有利于细胞的体外扩增和细胞表型的维持。本论文设计了一种简单、低成本且可批量化的方法，制备了京尼平交联的壳聚糖/氧化石墨烯复合微球。该复合微球具有良好的物理强度，能够保证细胞在培养过程中的长期稳定性。间充质干细胞能够在微球表面铺展和扩增，同时可以维持干细胞表型。此外，京尼平交联产生的自发荧光便于观察干细胞在微球支架表面的铺展和分布。因此，该部分研究提出了一种可批量化生产的壳聚糖/氧化石墨烯复合微球干细胞三维扩增体系，为本论文后续干细胞分化的相关研究提供了干细胞表型维持性良好的干细胞扩增方法。 2.有序纳米阵列介导的结构信号对干细胞成骨分化的调控:在对干细胞进行有效扩增的基础上，对干细胞分化的调控是组织工程研究最重要的内容。相比于生物化学因子，纳米结构对干细胞分化的调控被证实具有更好的生物稳定性和安全性。作为一种典型的纳米阵列，纳米柱阵列结构介导的结构信号对干细胞行为的影响多被研究，但纳米柱直径对干细胞分化的影响还少有报道。因此，该部分探究了不同纳米柱直径的聚乳酸纳米柱阵列介导的结构信号对干细胞成骨分化的调控作用。论文中以阳极氧化铝纳米孔衬底(AAO)为模板，用纳米压印的方法制备了不同纳米柱直径的聚乳酸纳米柱阵列，并将人脂肪间充质干细胞(hADSCs)接种于表面，探究在不含成骨诱导因子的条件下，不同纳米柱直径对hADSCs成骨分化的调控作用，并利用定量聚合酶链反应(q-PCR)和免疫染色等方法对干细胞的成骨分化进行检测。此外，本论文还测试了纳米柱阵列在动物体内诱导成骨分化的效果。因此，本论文为纳米阵列调控干细胞分化在组织再生领域的应用提供了重要的结构参数并证实了结构信号在体内应用的安全性和有效性。 3.光驱动表面等离激元纳米结构介导的电信号对干细胞神经分化的调控:在验证纳米结构对干细胞分化调控的有效性之后，本论文进一步探究了微纳米结构介导的其他物理信号是否对干细胞分化具有增强的调控效果。研究表明，神经的重建对骨组织等的组织修复具有促进作用，然而干细胞的神经定向分化较为困难，因此神经的有效再生对组织重建意义重大。基于以往的研究，电刺激是与神经分化密切相关的重要物理信号。因此，为了对间充质干细胞的神经分化实现更加有效的调控，在结构信号的基础上，该部分研究进一步引入了纳米结构介导的电信号等其他物理信号，探究了远程近红外光照射下表面等离激元纳米结构对hADSCs神经分化的影响，以期对神经分化调控产生增强的作用效果。将hADSCs培养在表面等离激元硫化铜(CuS)纳米结构表面并每天用近红外光(808 nm)进行照射，用q-PCR和神经标志物免疫荧光染色检测hADSCs的神经分化。实验结果表明，CuS衬底的纳米结构、等离子体热效应和强局域电场具有协同增强细胞神经相关基因表达的作用效果。因此，该部分研究利用表面等离激元纳米结构，通过施加远程近红外光对干细胞的神经分化进行了调控，证实了结构信号和电信号等物理信号对干细胞神经分化的调控作用。 4.超声驱动压电纳米结构介导的电信号对干细胞神经分化的调控:为发掘更多利用远程电信号对间充质干细胞神经分化进行调控的方式，并进一步提高间充质干细胞的神经分化效率，除了上述借助于近红外光的方式以外，本论文进一步探究了超声驱动压电材料介导的电信号对干细胞神经分化的调控作用。表面等离激元材料大多仅局限于金属和半导体等材料，而压电材料的选择范围则更为广泛，其中包括生物相容性更好的高分子材料。据报道，柔性基质更容易诱导干细胞的神经向分化，因此，该部分研究利用超声驱动的柔性压电纳米纤维素水凝胶介导的电信号等物理信号对hADSCs进行调控，并研究该过程对hADSCs神经分化的影响。在无任何神经分化诱导成分的条件下，培养在纳米纤维素水凝胶上的hADSCs已呈现出神经样的形态。对hADSCs的神经分化在基因和蛋白水平进行检测的结果表明，未经过超声处理的纳米纤维素水凝胶表面的hADSCs有向星形胶质细胞分化的趋势，而经过超声处理的hADSCs同时具有向星形胶质细胞和神经元分化的趋势，这在神经组织修复上将具有重要的应用前景。该部分研究证实，微纳米结构材料介导的结构信号、基质硬度信号、尤其是电信号等物理信号对干细胞的神经分化具有显著的调控作用效果，进一步印证了本论文的主题。 综上所述，本论文在纳米微结构复合材料微环境、纳米结构介导的结构信号、外场驱动纳米结构介导的电信号等方面，研究和讨论了材料表面微纳米结构介导的不同物理信号对干细胞命运的调控作用，这些研究和探索将进一步促进生物材料介导的物理信号在组织工程领域的应用和发展，为干细胞命运的调控提供新的思路和方法。
组织工程;微纳米结构;物理信号;干细胞扩增;干细胞分化
山东大学
博士
材料物理与化学
刘铎;刘宏
2021
中文
Q813.11
2021-08-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）