声表面波器件在微量细胞前处理中的研究与应用
声表面波(Surface acoustic wave，SAW)是自然界中存在的声波之一，其在地震波的研究中首先被发现。随着人们对SAW原理理解的深入和电子器件的制备工艺提升，人们于上个世纪利用压电晶体成功构建了SAW电子器件。SAW器件诞生后，迅速在精密电子传感器件领域占据了重要的地位。随着微纳加工技术的进一步发展，SAW应用越来越广泛，近年来被应用于生物医学材料领域，并显示了重要的应用前景。利用声场结构设计以及声波强度调节等方式可以对微纳米材料进行精确操控，因此诞生了“光镊”技术相对应的被称为“声镊”的技术。顾名思义，SAW声镊技术可以在微纳米尺度实现细胞的驱动、输运、富集、操控甚至裂解等一系列功能，在生物样品的处理中具有巨大的应用意义。 在对多细胞生物组织的样品中特定细胞中的目标生化分子进行传感测试之前，经过液化处理的生物样品常常需要经过三个必要且相关的步骤来进行处理，即样品的中细胞的分离提纯，细胞富集以及细胞裂解。从具有两种或两种以上尺寸相差仅为几微米的不同细胞的生物样品中将目标细胞进行精准分离往往使用离心的方法，分离效率率和样本捕获效果都较差。此外，当液体样本中出现样品浓度过低不能满足检测最低需求量的情况时，常用高速离心的方法解决。这不仅对设备性能要求更高，而且需要大量样本多次富集才能符合要求，因此亟待发展一种对微量液体样本中微纳米颗粒或者细胞的富集方法。对于经过分离纯化与富集的细胞样品而言，需要进行裂解才可以获得细胞内蛋白质和核酸等关键化合物以进行后续检测。常用的裂解设备常需要相当大的样本量，细胞裂解试剂因具有较强毒性对操作者具有一定的危害，因而迫切需要一种小样品、低浓度的细胞样品的的快速无害裂解方法。 基于以上问题，本论文将提出研究新型SAW微流体技术在微纳尺度上实现精确操控，实现细胞液体样品的前处理，提供新技术与新型SAW器件以实现细胞内容物的检查提供有效可靠的细胞操控与细胞内生化分子的释放。本研究将声学物理场的设计与生物细胞材料的声学特性进行结合，深入理解SAW在固体-液体界面传播特性，探究SAW对液体中对细胞和微粒行为的影响。同时，在对应的功能器件的设计制备的基础上，实现并观察了SAW微流体系中发生的声学干涉效应和声致微流效应，实现对动植物细胞的分离和细胞的高效裂解。还从理论上指出了自聚焦富集效应。本论文研究内容主要包括以下四个方面: (1)SAW激发传播特性及功能声场的设计和SAW功能器件的设计与制备 通过有限元仿真模拟在128°Y切X传的铌酸锂(128°YX-LiNbO3)晶体表面实现了SAW的激发与传播，观察到了特征模态与瞬态传播，验证了相关理论。进一步通过仿真实现了在层流结构中对中心样品流的位置分布调控，结合SAW驻波场仿真，实现了声驻波场对流体中直径分别为5μm和10μm的聚苯乙烯微粒(Polystyrene，PS)的快速分离。通过MATLAB建模计算讨论了在声驻波场与微流通道具有相对倾角时输入功率、通道流速和倾角角度对微粒的分离距离的影响。讨论了在铌酸锂衬底-微流通道壁上发生的声波耦合及其在通道壁-液体域界面处发生的全反射现象，进而发现了在铌酸锂衬底-微流通道壁-流体域的交点处的衍射波对流体域中声波传输的重要影响。经过平面波近似提出了衍射波与由铌酸锂衬底耦合进入流体域的漏波发生干涉的效应，进而指出这一发现有望实现微纳米微粒富集。此外，利用SAW对微量液滴中的声致微流效应，研究了微量细胞液滴中加入的尺寸不同的微粒后对细胞的冲击与破碎作用机制，优化条件实现了细胞的高效裂解。根据以上理论利用微纳加工技术设计并制备了相应的功能器件，搭建了驱动测试系统。 (2)基于驻波SAW的微粒偏移和动植物细胞分选 通过调节入口鞘层流和样品流的流速，实现对微流通道中样品流及其中微粒的位置进行调控。发现了在层流界面的溶解度变化导致的磷酸盐缓冲液的析晶浑浊现象，利用这种现象实现了对SAW驻波场的可视化观察。在与声场相平行的微流通道中观察到人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)与人白血病细胞(Jurkat)细胞在声场作用下的快速偏移，实现了对两种细胞混合样本的快速分选。在与声场有倾角的微流通道中观察到了对应倾角角度的聚乙烯微粒侧向偏移以及其在出口的分选。针对不同材料具有的不同声学特性在相对倾角为15°的微流通道中分别实现了聚苯乙烯微粒、动物细胞、植物细胞的不同尺寸同种微粒的分选，以及相近尺寸不同密度两种微粒的分选。首次在SAW微流体系中实现了花粉分选以及完整花粉与生殖细胞的分选。 (3)自聚焦SAW干涉场诱导的微纳米颗粒富集 对微流通道壁-铌酸锂衬底-流体域界面交汇点的振动场进行研究，讨论其经压电衬底振动激发产生的“衍射波”的形成机制。讨论平面波近似下，该“衍射波”与由铌酸锂衬底表面耦合进入流体中漏波引起的干涉现象。研究了在特定尺寸通道内仅存在单个时域平均后的低声压中心时的干涉声场特征。通过体积力以及声流场分析确定流体中的微粒富集趋势。发现不同流道壁材料以及液体声速中的干涉声场，分析其对声场分布的影响。通过对声场中的微粒流动轨迹分析，实现了对直径为10μm和5μm微粒的快速富集。在分析具有不同通道尺寸比例的通道内曳力和声辐射力的大小以及力之比的分布的基础上，优化了具有更强富集能力的微流通道尺寸比例，实现了直径为800nm和500nm的亚微米颗粒快速富集，并有望实现纳米颗粒的快速分离与富集技术。 (4)SAW诱导的液滴内细胞-微粒碰撞致细胞高效裂解 利用声致微流效应，实现在SAW传播路径上液滴内部的流体的高速运动。液滴内流体的高速运动能够带动液滴内的细胞与其他微粒快速运动，因为不同密度、不同尺寸的颗粒活细胞的运动速度与加速度不同，细胞与颗粒之间发生高频碰撞，从而实现细胞快速裂解。对细胞裂解的原理及过程进行了系统研究，提出了细胞在裂解前后的合外力变化分析。通过台盼蓝染色快速判断经由SAW作用前后的细胞裂解效果，研究微粒存在、输入功率、裂解时间、液滴体积以及微粒尺寸对细胞裂解效率的影响。通过活细胞染色试剂CalciumAM染色确定细胞裂解前后膜功能的完整性，通过细胞膜染色试剂DiO与红色荧光蛋白RFP的共同作用确定细胞裂解前后细胞膜结构和功能的变化。结合扫描电镜图提出细胞-微粒碰撞裂解模型，通过对选用的微粒材料和细胞的动力学估算辅证了模型的理论可行性。此外，本文实现了多种细胞的高效裂解，为低浓度、微量细胞的裂解与细胞质释放的应用提供了指导。 综上所述，本论文提出了基于SAW的微流体生物样品前处理方法，实现了基于SAW驻波场、SAW干涉场和声致微流效应在细胞分选、富集和裂解方面的应用。通过仿真理论设计并构建了不同的应用器件，使用驻波SAW器件实现了声驻波场中的微粒偏移，进一步实现了动植物细胞的分选并首次实现了花粉与生殖细胞的分选。通过微扰理论对SAW干涉场进行研究，实现了快速的微米尺寸微粒富集，通过调节微流通道结构参数实现了亚微米尺寸微粒富集，并为纳米微粒富集提供了方法。此外，利用声致微流新效应驱动了液滴内细胞与微粒的高速运动与碰撞，实现了多种细胞的快速高效裂解。本文的研究工作为SAW开拓了新的应用领域，其研究结果将对微量细胞的分离、聚集和细胞内生化分子的释放提供了多种“声镊”操作平台。
声表面波;微流体器件;微纳米富集;传感器;微量细胞
山东大学
博士
材料物理与化学
刘宏;陈弘达
2021
中文
TP212
2021-08-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）