甲状腺相关眼病视网膜血管密度观察及眼眶成纤维细胞中NF--κB抑制剂的治疗作用研究
第一部分:不同病程甲状腺相关眼病的视盘及黄斑区血密度研究 目的:采用相干光层析血管成像术(OCTA)分析不同病程甲状腺相关眼病(TAO)患者的视盘及黄斑区血管密度特征，及其与视功能的相关性。 方法:病例对照研究。纳入2019年6月至2019年9月就诊于北京协和医院眼科的TAO患者及同期的健康志愿者。TAO临床活动性评分(CAS)评分≥3分的患者为活动期组，患有甲状腺相关眼病视神经病变(DON)且病程≤6个月的患者为DON急性期组，患有DON且病程＞6个月的患者为DON慢性期组，健康志愿者为对照组。每组纳入受检者12例，研究均取右眼进行分析。所有受试者行最佳矫正视力(BCVA)、非接触性眼压(NCT)、裂隙灯联合前置镜检查、眼轴长度测量及视野检查并分析平均缺损(MD)，采用相干光层析成像术测量视网膜神经纤维层(RNFL)及视网膜神经节细胞复合体(GCC)厚度，采用相干光层析血管成像术(OCTA)测量视盘结构参数、视盘及黄斑区血管密度。BCVA随后转换为最小分辨角对数视力(LogMAR)。分析各组间视盘及黄斑区血管密度的差异及其与不同因素的相关性。采用方差分析(ANOVA)、非参数Mann-WhitneyU检验及Spearman相关性分析进行统计学分析。 结果:共纳入受检者48人，受检者总体年龄(45±11)岁，4组间年龄差异无统计学意义(均P＞0.05);各组性别匹配，男性、女性均为6人。DON急性期组LogMAR为0.1(0，0.2)，较对照组0(0，0)差，差异有统计学意义(U=114.000，P＜0.05)。DON急性期组及DON慢性期组视盘全层整体血管密度(54.70％±2.31％、54.31％±3.65％)均低于对照组(62.54％±3.91％)，差异有统计学意义(t=3.104，2.636;均P＜0.05)。TAO活动期组、DON急性期组和DON慢性期组黄斑区浅层整体血管密度(46.07％±3.06％、42.26％±5.05％、45.63％±3.87％)均低于对照组(49.34％±3.08％)，差异有统计学意义(t=2.614，4.147，2.603;均P＜0.05)。4组间黄斑中心凹无血管区面积及黄斑区深层血管密度的差异均无统计学意义(均P＞0.05)。TAO活动期组视盘及黄斑区血管密度与视野平均缺损值、RNFL及GCC厚度均无相关性(均P＞0.05)。DON急性期组视盘全层整体血管密度与视野平均缺损值呈负相关(r=-0.591，P=0.043)，与RNFL、GCC厚度呈正相关(r=0.595，0.693;P=0.041，0.013);DON慢性期组视盘整体毛细血管密度与视野平均缺损值呈负相关(r=-0.673，P=0.017)，黄斑区浅层整体血管密度与RNFL、GCC厚度呈正相关(r=0.732，0.712;P=0.007，0.009)。 结论:DON急性期患者BCVA受疾病影响较大。TAO活动期仅黄斑区浅层血液供应减少。DON急、慢性期黄斑区浅层和视盘的血液供应均减少，且血管密度越小，视野缺损越严重，RNFL及GCC厚度越薄。 关键词:甲状腺相关眼病，视神经病变;局部血流;体层摄影术，光学相干 第二部分:眼眶成纤维细胞中NF-κB抑制剂对甲状腺相关眼病的治疗作用 目的:检测地塞米松、IMD-0354、吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对NF-κB通路相关转录因子和炎性因子的调节，探索NF-κB抑制剂是否可与糖皮质激素联合抗炎。 方法:获取TAO限制性斜视及其他斜视患者的眼眶结缔组织，培养并分离原代眼眶成纤维细胞(OFs)，传代3-5代后用脂多糖(LPS)诱导炎症，加入不同浓度梯度的地塞米松(DEX)。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测两组OF中白细胞介素-6(IL-6)、透明质酸合酶1、2、3(HAS1、HAS2、HAS3)mRNA的表达水平。电泳迁移率变动分析(EMSA)检测两组OFs细胞核内NF-κB结合力，筛选出最佳DEX浓度。分别加入NF-κB抑制剂IMD-0354、PDTC进行药物干预。RT-qPCR法分别检测两组OFs中IL-6、HAS1、HAS2、HAS3mRNA的表达水平;WesternBlot法检测P65、磷酸化的P65(p-P65)、IκBα、磷酸化的IκBα(p-IκBα)的表达水平。 结果:纳入实验组、对照组OFs各9例。RT-qPCR结果显示，在加用不同浓度的DEX后作用2小时，实验组IL-6相对表达量达到最低点;10-6MDEX作用2小时的IL-6相对表达量均显著小于10-7M、10-8M(均P＜0.05)。实验组用不同浓度DEX作用2小时，HAS1、HAS2、HAS3相对表达量减少(均P＜0.05)。EMSA实验示DEX作用0.5小时后，两组OFs的NF-κB与靶基因结合力最强。选取10-6M为DEX最适浓度，2H为最适时间。在加入两种NF-κB抑制剂后，RT-qPCR结果显示，与LPS+DEX组相比，实验组5μMIMD-0354、5μMIMD-0354+DEX和100μ-MPDTC+DEX可有效抑制IL-6生成(均P＜0.01)，5μMIMD-0354可有效抑制HAS2和HAS3生成，差异均有统计学意义(均P＜0.05);对照组5μMIMD-0354、1μMIMD-0354+DEX、5μMIMD-0354+DEX和100μMPDTC可有效抑制HAS2和HAS3生成，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。Westernblot结果显示，实验组OFs应用5μMIMD-0354与DEX联合联合用药、50μMPDTC、100μMPDTC单独用药或与DEX联合联合用药，可有效降低NF-κBP65、p-P65、IκBα、p-IκBα的产生(P＜0.001)。 结论:OFs在LPS刺激后HAS1、HAS2、HAS3及IL-6表达水平显著增高，其水平受地塞米松抑制。IMD-0354、PDTC可联合DEX有效降低TAO患者OFs的NF-κB通路上炎性因子和转录因子的表达水平。IMD-0354、PDTC可作为DEX治疗TAO的联合用药，增加抗炎效果。
甲状腺相关眼病;眼眶成纤维细胞;NF-κB信号通路;IMD-0354;PDTC
中国医学科学院北京协和医学院
博士
眼科学
钟勇
2020
中文
R777.5
2021-06-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）