Kallmann综合征伴ANOS1基因突变患者的特征分析和促性腺激素治疗部分性CHH患者的生精疗效研究
第一部分Kallmann综合征伴ANOS1基因突变患者的特征分析 背景 ANOS1基因是Kallmann综合征发现的第一个致病基因，其位于X染色体上，属于X连锁的遗传形式，编码蛋白质anosmin-1。ANOS1基因突变引起anosmin-1蛋白功能异常，进而导致GnRH神经元及嗅神经元的迁移受损，引起Kallmann综合征。本研究深入探讨大样本量单中心的Kallmann综合征中国队列中ANOS1基因突变的情况，分析临床表型与基因突变的关系，并完成了新发突变位点的生物功能验证。 目的 1.筛查212例中国男性Kallmann综合征患者的ANOS1基因突变情况。 2.判断新发ANOS1基因突变是否致病，且其与临床表型的关系。 对象和方法 研究对象:2010年1月至2017年10月共招募就诊于北京协和医院内分泌科的散发性中国Kallmann综合征男性患者，且同意进行致病基因筛查的患者，共入组212例。 研究方法: 1.基因筛查:采用目标序列捕获结合二代测序的方法筛查入组Kallmann综合征患者相关的31个基因。将检出的ANOS1突变基因进行Sanger测序验证。 2.临床研究:收集Kallmann综合征患者临床资料，整理其中ANOS1基因突变患者的临床特点。 3.新发突变基因型与表型相关性:利用Polyphen-2、SIFT、MutationTaster、MutationAssessor和Provean等五种生物预测软件对ANOS1的新发错义突变位点进行功能预测;利用Humansplicingfinder和Splicesitescorecalculation等两种生物预测软件对ANOS1的新发剪切突变位点进行功能预测。 4.体外功能验证实验:Transwell迁移实验验证新发错义突变是否致病。 5.总结不同位点的突变导致Kallmann综合征患者的临床特点，探讨表型与基因型的关系。 结果 1.本研究共纳入212例Kallmann综合征患者，其中22例有ANOS1基因突变，在这些患者中隐睾患病率高达36.4％(8/22)，肾发育不全的概率达到18.2％(4/22)，一例出现双手的镜像运动，嗅神经MRI异常的患者100％出现嗅觉异常 2.本研究共发现ANOS1的19个突变，包括8个错义、5个无义、3个剪接位点和3个移码突变，其中8个突变既往已报道过(p.R257X、p.W258X、p.R262X、p.R423X、p.R424X、p.Y579fs、p.V560I、c.1843-1G＞A)。新发现2个移码突变(p.P135fs、K512fs)，7个错义突变(p.A140G、 p.C147Y、 p.C157R、 p.C164F、 p.C164S、p.A264P、p.P504L)，2个剪接位点突变(c.1207+1G＞c、c.1449+1G＞A)。所有新的错义突变经五种生物软件计算后都被认为是致病的。两个新发的剪切位点突变其突变位点位于人类最经典的剪切位点(GT-AG序列)上，经两个剪切预测软件(Humansplicingfinder和Splicesitescorecalculation)预测均考虑致病可能性高。 3.体外Transwell实验验证ANOS1基因突变功能对NLT细胞迁移的影响。七种ANOS1新发错义突变的迁移能力均明显少于ANOS1野生组。 结论 1.Kallmann综合征患者伴有ANOS1基因突变者更易出现累及其它非生殖系统的临床表型。 2.本研究中共发现ANOS1的19个突变，再次确认了其中8个已报道位点的突变，新发现了11个ANOS1突变位点，并对其中的错义突变进行功能验证，明确其致病性，这些突变扩大了ANOS1突变谱，为产前诊断和遗传咨询提供了基础。 第二部分促性腺激素治疗部分性CHH患者的生精疗效研究 背景 先天性低促性腺激素性性腺功能减退症(Congenital hypogonadotropic hypogonadism，CHH)发生主要原因与下丘脑分泌的GnRH相关(分泌不足或作用障碍)，从而导致的一组在临床表型和遗传方式上罕见的异质性生殖障碍疾病。根据青春期发育程度，CHH患者可分为部分性CHH(Partial congenital hypogonadotropic hypogonadism，PCHH)和完全性CHH(Complete congenital hypogonadotropic hypogonadism，CCHH)，以往对部分性CHH的研究主要局限于症状描述和突变基因的鉴定。目前还没有关于双促性腺激素(绒促性腺激素联合尿促性腺激素)治疗中国人部分性CHH治疗预后和部分性CHH突变基因的综合研究分析的报道。本研究通过对促性腺激素生精治疗部分性CHH患者预后及相关突变基因的研究，为临床开展治疗提供依据。 目的 1.分析应用双促性腺激素生精治疗下部分性CHH患者与完全性CHH患者精子生成的区别及相关差异原因 2.部分性CHH患者与完全性CHH患者进行致病基因突变的筛查，以明确不同突变对患者临床表现的影响。 对象和方法 研究对象: 2008年1月至2016年9月就诊于北京协和医院内分泌门诊后确诊为CHH的男性患者，并接受规律促性腺激素治疗两年且无隐睾史者(122例) 研究方案:回顾性分析 治疗及随诊方案:所有患者均按照指南给予绒促性腺激素联合尿促性腺激素肌肉注射治疗。每3-6个月进行一次随诊，每次随诊记录患者身高、体重、睾丸体积、性腺激素水平、精子生成等情况。 致病基因筛查:87名患者接受二代测序筛查31种CHH相关基因突变。 结果 1.CHH患者按睾丸体积是否≥4ml分为部分性CHH(n=39)组(睾丸体积≥4ml)和完全性CHH(n=83)组(睾丸体积＜4ml)。经规律两年双促性腺激素治疗后，与完全性CHH组(74.7％)相比，部分性CHH组生精率高达92.3％(P=0.023);部分性CHH组首次精子出现时间11.7±6.8个月，较完全性CHH组首次精子出现时间提前了半年(17.8±6.2个月)(P＜0.00l)，每半年随访时部分性CHH组精子浓度均明显高于完全性CHH组，且在6、12、24个月时这种差异是有统计学意义的。 2.共有87名患者接受31种CHH相关致病基因的筛查，其中28例CHH患者通过二代测序筛查出CHH相关致病基因变异，其检出率约为32.2％(28/87)。共检出9种致病基因的28处位点突变，其中7个突变位点为已知致病突变，有21处为新发突变。在部分性CHH组和完全性CHH组中均发现FGFR1、ANOS1、PROKR2和CHD7突变，说明相同基因的突变可导致不同程度的表型，导致不同的预后。LHB和NELF突变仅见于部分性CHH组，在完全性CHH组中没有检测到这些突变。GNRHR、FGF8和PROK2突变仅存在于完全性CHH组存在，在部分性CHH组中没有检测到这些突变。 结论 1.部分性CHH定义为初诊时基础睾丸体积≥4ml的CHH患者;完全性CHH定义为基础睾丸体积＜4ml的CHH患者。 2.在两年规律的促性腺激素治疗的过程中，部分性CHH患者组较完全性CHH患者组精子生成率更高，且精子初现的时间更短，在相同治疗时间下，部分性CHH患者产生精子的平均密度要远高于完全性CHH患者，成功生成精子的患者比率也高于完全性CHH组。 3.FGFR1、PROKR2、CHD7、ANOS1等基因突变即可导致部分性CHH也可导致完全性CHH，根据目前的研究尚未发现仅可导致部分性CHH的基因突变，基因检测的结果说明:部分性CHH与完全性CHH患者检测出的基因突变的概率一样，对于已经明确有致病基因突变的患者，两组之间生精治疗不能成功的比率均较高，因此应该重视基因检测的结果，以期寻找到对症治疗方法。
Kallmann综合征;ANOS1基因;促性腺激素治疗;精子生成
中国医学科学院北京协和医学院
博士
内分泌与代谢学
伍学焱
2020
中文
R588
2021-06-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）