非天然人参皂苷代谢途径在酿酒酵母中的构建及优化
人参皂苷(Ginsenosides)是中国传统名贵药材人参(Panax ginseng)的主要生物活性成分，具有抗肿瘤、抗衰老、免疫调节和神经保护等多种药理活性。人参皂苷可分为两种类型:一类是达玛烷型四环三萜类皂苷;一类是齐墩果烷型五环三萜类皂苷。达玛烷型皂苷在人参皂萤中占主要成分，也是人参皂苷的主要活性成分。达玛烷型人参皂苷又可分为二醇型皂苷和三醇型皂苷。二醇型皂苷由原人参二醇(Protopanaxadiol，PPD)的C-3和C-20位羟基糖基化而生成;三醇型皂苷由原人参三醇(Protopanaxatriol，PPT)的C-6和C-20位羟基糖基化而生成。目前，尚未从人参属植物中分离得到C-12位羟基发生糖基化的皂苷。本实验室从枯草芽孢杆菌中克隆到一个糖基转移酶基因UGT109A1，发现该酶能够催化原人参二醇的C-3和C-12位羟基发生糖基化;将该基因和PPD生物合成相关基因共转入酿酒酵母，成功构建了产具有抗肿瘤活性的非天然人参皂苷3β,12β-Di-O-Glc-PPD的工程菌。由于该工程菌中菌中，12β-Di-O-Glc-PPD产量较低，而3β，12β-Di-O-Glc-PPD的直接前体PPD积累较多，因此推测糖基转移酶UGT109A1是一个限速酶，提高糖基转移酶UGT109A1的催化活性可能提高3β，12β-Di-O-Glc-PPD的产量。本论文对糖基转移酶UGT109A1进行三维结构预测，与底物分子PPD进行分子对接，对该酶的“Hotspot”进行丙氨酸扫描，并对突变后活性提高幅度较大的位点进行半饱和突变;对UGT109A1其中的几个关键位点进行突变，并分别与PPD生物合成相关基因共同整合到酿酒酵母基因组上，获得了3β，12β-Di-O-Glc-PPD产量明显提高的工程菌。具体结果如下: (1)为了提高UGT109A1对底物PPD的催化活性，采用丙氨酸扫描技术对UGT109A1进行了结构与功能关系的初步研究，发现在预测的15个Hotspot位点中，H16、F231、M315和E317位点突变使糖基转移酶UGT109A1完全丧失对PPD的催化活性，表明这些位点可能是糖基转移酶UGT109A1对PPD起催化作用的关键位点，可能包含酶的底物结合位点和催化位点;L80、V108、F136和L138位点突变会使糖基转移酶UGT109A1对PPD的催化活性降低，表明这些位点对维持酶活性至关重要。而I11、E69、K73、T77、F107、S129和L171位点的突变则可以不同程度地提高糖基转移酶UGT109A1对PPD的催化活性，其中K73A突变体提高幅度最大。在相同酶促反应条件下，K73A的相对活性是野生型UGT109A1的14.0倍;E69A的相对活性是野生型UGT109A1的12.4倍;L171A的相对活性是野生型UGT109A1的11.5倍。 (2)采用半饱和突变的方法对相关位点进行深入研究，发现在E69位点的突变中，E69A的相对活性提高幅度最大，是野生型UGT109A1的12.4倍:在K73位点的突变中，K73A的相对活性提高幅度最大，是野生型UGT109A1的14.0倍;在L171位点的突变中，L171F的相对活性提高幅度最大，是野生型UGT109A1的11.7倍。 (3)在糖基转移酶UGT109A1突变体K73A最适pH的研究中发现，突变体的最适pH为11，但在pH大于等于11.5时，该酶对PPD的催化活性完全丧失。在糖基转移酶UGT109A1突变体K73A最适温度的研究中发现，该酶的最适温度为38℃。 (4)利用体外OE-PCR技术构建了3β，12β-Di-O-Glc-PPD生物合成功能模块，将E69A、K73A和L171F突变体分别与PPD的生物合成相关基因共同整合到实验室前期优化的酿酒酵母底盘细胞Y-AHXK2中，构建了产3β，12βDi-D-Glc-PPD的酵母工程菌。与野生型对照组相比，3β，12β-Di-O-Glc-PPD的产量有所提高，工程菌YU-E69A中3β，12β-Di-O-Glc-PPD产量是对照菌的1.70倍，工程菌YU-K73A中3β，12β-Di-O-Glc-PPD产量是对照菌的1.84倍，工程菌YU-L171F中3β，12β-Di-O-Glc-PPD产量提高最多，是对照菌的3.07倍。这些结果表明UGT109A1经过改造后，能够在生物体内表现出更好的催化活性。 上述研究为提高酵母工程菌中非天然人参皂苷3β，12β-Di-O-Glc-PPD的产量提供了新思路，为继续对产3β，12β-Di-O-Glc-PPD工程菌进行优化奠定了基础，也为进一步研究3β，12β-Di-O-Glc-PPD的药理活性及其新药开发奠定了基础。 本实验室前期构建了产抗肿瘤达玛烯二醇糖苷20S-O-D-吡喃葡糖基-达玛-24-烯-3β，20S-二醇(20S-O-D-glucopyranosyl-dammar-24-ene-3β，20S-diol，简称为20S-O-Glc-DM)的酵母工程菌，并通过优化底盘细胞、过表达上游途径基因、抑制羊毛甾醇合酶表达以及过表达转录因子等策略，对工程菌进行了优化。本论文对在摇瓶水平上筛选出的产量最高的工程菌Y7CSH进行了高密度发酵，进一步提高了20S-O-Glc-DM的产量。具体结果如下: 通过对高密度发酵工艺进行初步探索，在采用指数流加法进行补料的情况下，通过控制通气量为3L/min，转速与溶氧串联维持溶氧值在30±5％范围内，发酵液pH值在5.5±0.2范围内，发酵液中葡萄糖和乙醇含量分别低于1.0g/L和5.0g/L等条件，工程菌Y7CSH在培养192h收罐时20S-O-Glc-DM的产量可达到5.6g/L。 上述研究为大量制备非天然人参皂苷20S-O-Glc-DM提供了一种绿色环保且可持续的新方法，也为深入开展化合物的创新药物研发奠定了基础。
非天然人参皂苷;糖基转移酶;蛋白质工程;酿酒酵母;微生物细胞;代谢途径
中国医学科学院北京协和医学院
硕士
药学
杨金玲
2020
中文
R915
2021-06-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）