二萜类化合物紫杉醇和丹参酮的生物合成与调控研究
二萜类天然产物及其衍生物是药物开发的重要来源，紫杉醇和丹参酮是其中代表性化合物。紫杉醇是来源于红豆杉属植物的一种四环二萜类化合物，在治疗卵巢癌、乳腺癌等疾病方面效果显著，是目前销量最高的植物药之一;丹参酮属于松香烷型二萜醌类化合物，是大宗中药材丹参的主要有效成分之一，对心脑血管疾病具有显著的疗效。本论文通过高通量测序等技术对紫杉醇和丹参酮的生物合成及其转录和转录后调控机制进行了研究。 为了研究紫杉醇的生物合成及其调控，分别利用Illumina和Pacbio测序平台对东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.)根、茎和叶的转录组进行测序，共获得58，602个unigenes，其中13，636个unigenes具有可变剪切事件，RT-PCR证实可变剪切基因存在组织特异性模式。通过基因功能注释发现139个细胞色素P450(CYP450)、31个BAHD酰基转移酶和1，940个转录因子(TF)。其中79个CYP450是首次从东北红豆杉中获得，66个为裸子植物特有CYP450;基于序列基序分析、进化分析和共表达分析，预测9个CYP450、7个BAHD酰基转移酶和6个TF可能参与紫杉醇的合成及调控。本研究建立了无参考基因组物种的三代转录组分析和次生代谢相关基因发掘的技术体系，为通过高通量测序技术研究次生代谢途径及可变剪切等转录后调控机制奠定了基础。 前期丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge.)基因组测序研究发现丹参酮合成相关基因在基因组中可能以基因簇的形式存在。本研究通过构建和筛选丹参BAC文库，并利用Illumina和Pacbio平台联合测序技术获得了两条丹参酮生物合成基因簇，长度分别为374.44kb和464.46kb。两条基因簇均含有7个CYP450、3个萜类合酶、2个TF、1个F-box蛋白基因。基因簇上的CYP450、TF和F-box蛋白基因大多为串联重复基因，其中一些基因在两个基因簇中的拷贝数不同。这两条基因簇上均含有已鉴定功能的丹参酮骨架合成酶基因CPS1、CPS2和KSL1，及参与骨架修饰的基因CYP76AH1和CYP76AH3，证明了丹参生物合成基因簇的真实存在。克隆基因簇上的4个CYP450和3个已知功能的CYP450，在酿酒酵母中进行异源表达。用21个丹参酮类化合物测试这7个酶的催化活性，证实CYP71D410对铁锈醇，新隐丹参酮Ⅱ和20-去氧鼠尾草酚有催化活性。核磁共振结果表明CYP71D410使铁锈醇C-3位羟基化产生花柏酚。构建CYP71D410基因的毛状根RNA干扰体系进一步验证了其在丹参酮合成途径中的重要作用。丹参酮生物合成基因簇的发掘与鉴定为整个丹参酮途径的解析奠定了基础，并将进一步加深人类对于植物基因簇的一些基本生物学问题的认知。 植物激素脱落酸(ABA)可以增加多种植物中次生代谢产物的积累。为了研究脱落酸对丹参有效成分的影响，本研究采用NanoporePromethION平台对ABA处理前后的丹参的根和叶进行转录组测序，共获得了63，213，822条cleanreads，去冗余后得到58，487条转录本。大约50.0％基因的表达受ABA影响，其中参与花青素合成、糖基转移等基因表达量显著上调，参与黄酮合成、甲基转移等基因表达量显著下调。丹参中约61.0％的基因经历了可变剪切事件，其中内含子保留是主要类型。ABA诱导后剪切事件数目总体呈现减少的趋势，表明ABA可影响丹参的可变剪切。在5种可变剪切事件中，内含子保留事件受到ABA的影响最大。丹参叶中剪切事件受到ABA的影响比根中的大，证实了可变剪切事件对ABA的响应具有组织特异性的特点。参与ABA信号转导途径的一些基因受到ABA诱导后，产生的剪切异构体数目显著增多，推测可变剪切可能参与ABA信号转导途径的调控。丹酚酸途径基因受ABA诱导后上调表达，推测ABA能促进丹酚酸的合成;参与丹参酮生物合成的基因基本不受ABA的诱导。本研究表明ABA可以从转录和转录后调控等多个层次影响次生代谢产物的生物合成。 紫杉醇和丹参酮的生物合成途径的解析为其合成生物学研究提供了有用的“元器件”，为通过构建“细胞工厂”合成紫杉醇、丹参酮及其中间产物，进而推动相关药物的生产和研发奠定了基础。同时，紫杉醇和丹参酮代谢途径调控机制的阐明可为分子育种研究提供“功能性”分子筛选标记，加速优良品种选育进程，推动相关中药产业的可持续发展。
紫杉醇;丹参酮;基因簇;生物合成;脱落酸
中国医学科学院北京协和医学院
博士
生药学
孙超
2020
中文
R284.3
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）