淫羊藿苷干预骨微血管内皮细胞防治激素性股骨头坏死的实验研究
第一部分激素性股骨头坏死患者骨微血管内皮细胞功能改变的研究 目的:骨微血管内皮细胞(Bone microvascular endothelial cells，BMECs)功能障碍引起的股骨头微循环障碍对激素性股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)的发生发展具有重要意义。本研究通过分离来自激素性ONFH和股骨颈骨折患者的BMECs，比较两个群体BMECs的血管功能和凋亡活性的差异。 方法:本研究共纳入12名患者，ONFH组为激素性ONFH患者，对照组为股骨颈骨折，每组6名患者。ONFH组包括3例女性和3例男性(平均年龄51.7±5.2岁)，而对照组包括5例女性和1例男性(平均年龄65.3±2.9岁)。BMECs从两组股骨头软骨下分离获得，并用细胞免疫荧光实验进行鉴定。应用细胞增殖、细胞活力实验、Transwell迁移实验、体外成管实验、TUNEL实验和Westernblot比较两组细胞的功能。 结果:来自两组分离的细胞在光镜下都形成典型的鹅卵石样的内皮细胞形态，免疫荧光都表达CD31和vWF，这表明分离的细胞是BMECs。两组间细胞增殖无明显差异(P＞0.05)。与对照组相比，ONFH组BMECs的细胞活力、体外成管和迁移能力均显著降低而TUNEL阳性细胞数明显增加(P＜0.05)。Westernblot检查显示ONFH组Bax和cleaved-caspase3蛋白表达显著升高，而Bcl-2蛋白表达显著下降(P＜0.05)。 结论:激素性ONFH患者中获得BMECs血管生成活性的降低而细胞凋亡活性明显增加，这可能是激素性ONFH的重要的发病机制。 关键词:骨微血管内皮细胞;血管生成;凋亡;股骨头坏死;糖皮质激素 第二部分淫羊着苷对激素干预下骨微血管内皮细胞功能影响的研究 目的:糖皮质激素在临床上常常用于自身免疫性和炎症性疾病的治疗，是引起股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)最常见的原因。激素性ONFH的发病机制与骨微血管内皮细胞(Bone microvascular endothelial cells，BMECs)功能障碍有着密切关系。研究表明淫羊藿苷(Icariin，ICA)具有保护血管内皮细胞和促进血管生成的功效。然而，ICA是否可以干预激素性BMECs促进血管生成尚不十分清楚。本研究通过体外实验验证上述假说。 方法:BMECs从股骨头软骨下分离和培养，并用细胞免疫荧光染色鉴定。CCK-8法检测细胞增殖，细胞划痕实验、Transwell迁移实验和体外成管实验测定体外血管生成能力。RT-qPCR检测VEGF、CD31、vWF和PDGF-B的mRNA表达。Westernblot检测VEGF、Akt、p-Akt、Bax和Bcl-2蛋白的表达。 结果:光镜下显示分离的细胞形成典型的鹅卵石样的内皮细胞形态，细胞免疫荧光表达CD31和vWF，这表明分离的细胞是BMECs。CCK-8结果显示，0.1mg/mL氢化可的松明显抑制BMECs细胞增殖而ICA(10-5M)则显著促进BMECs增殖。ICA显著促进BMECs迁移和体外成管。RT-qPCR结果显示氢化可的松明显抑制CD3lmRNA的表达，而ICA显著上调CD31mRNA的表达。Westernblot结果显示ICA促进了VEGF的表达和Akt活化。同时，ICA能降低Bax蛋白的表达水平和促进Bcl-2蛋白的表达水平。 结论:ICA在体外实验中能减轻氢化可的松所致的BMECs激素性损伤，能明显改善激素性BMECs的细胞活力、迁移能力和成血管能力，促进BMECs血管生成，具有保护作用。 关键词:骨微血管内皮细胞;股骨头坏死;糖皮质激素;血管生成;淫羊藿苷 第三部分淫羊藿苷预防和治疗大鼠激素性股骨头坏死的研究 目的:研究激素性股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)的预防和治疗具有重要临床意义。淫羊藿苷(Icariin，ICA)可以减轻糖皮质激素对BMECs引起的细胞损伤，能明显改善激素性BMECs的细胞活力、迁移能力和成血管能力，具有保护血管的作用。为了进步研究ICA在体内能否通过保护血运预防和治疗激素性ONFH，我们通过构建大鼠激素性ONFH动物模型进行疗效评估。 方法:8周龄、健康的30只SD大鼠随机数字表法分为对照组、MP组(甲强龙，Methylprednisolone)和MP+ICA组三组，每组10只SD大鼠。MP组和MP+ICA组的大鼠采用脂多糖和甲强龙联合应用的方法建立大鼠激素性ONFH动物模型。MP+ICA组的大鼠每日灌胃给药60mg/kgICA，对照组和MP组的大鼠给以相同ICA剂量的生理盐水灌胃。所有大鼠6周后处死，从大体标本，苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining，HE)，MicroCT、免疫组化和股骨头血管造影评估ICA的防治疗效。 结果:30只SD大鼠实验期间均存活。HE染色结果显示与MP+ICA组相比，MP组可见较多空腔骨陷窝和坏死骨髓细胞，对照组未见空腔骨陷窝和坏死骨髓细胞。对照组、MP组和MP+ICA组ONFH的发生率为分别0(0/10)，20％(2/10)和80％(8/10)。MicroCT结果显示与MP+ICA组相比，MP组的大鼠股骨头软骨下骨密度较低，厚度较薄，骨微结构破坏，骨密度明显降低，对照组的大鼠股骨头软骨下骨完整，分布均匀，骨结构没有破坏。免疫组化显示对照组CD31阳性细胞数量最多，MP组坏死区无完整血管结构存在，棕染的CD31阳性细胞数量最少，MP+ICA组可见完整血管结构，CD31阳性细胞数较MP组明显增多。血管照影显示:对照组的大鼠股骨头血管丰富而MP组的大鼠股骨头血管明显破坏，血管数量减少明显;MP+ICA组大鼠股骨头血管数量较对照组也有减少，但较MP组明显增多。 结论:我们体内动物实验研究发现ICA能够延缓大鼠激素性ONFH的进展，具有保护大鼠股骨头血运的作用。这为ICA预防和治疗激素性ONFH的治疗提供新的认知。
股骨头坏死;糖皮质激素;淫羊藿苷;血管生成;动物实验
中国医学科学院北京协和医学院
博士
外科学（骨外）
郭万首
2020
中文
R681.8
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）