远志提取物抗抑郁作用及机制研究
抑郁症是一种常见的精神疾病，以心境低落、快感缺失、睡眠和认知障碍为主要特点，严重威胁人类的身心健康。虽然已有大量的抗抑郁药物上市，然而，目前抑郁症患者对治疗的响应率较低。另外，较多的不良反应也限制了抗抑郁药物的临床应用，因此研发更加安全有效的抗抑郁药物成为当今的迫切需求。远志是我国常用的传统中药，对中枢神经系统具有较好的保护作用。 抑郁症的病因复杂，其病理机制尚未完全阐明。新近发展起来的代谢组学技术为抑郁症发病机理和抗抑郁药物作用机制的研究提供了有力支持。嗅球切除(olfactory bulbectomy，OBX)诱导的大鼠是较早应用于抑郁症研究的动物模型，然而OBX大鼠体内的代谢物改变并不清楚。现有的研究初步证明远志具有一定的抗抑郁作用，然而，对远志抗抑郁活性的评价并不全面，对其作用机制的研究不够深入。本研究首次采用代谢组学技术探究OBX模型大鼠尿液和海马代谢物特征的变化，并揭示OBX大鼠脑内调节能量的信号通路及自噬的改变;同时，采用小鼠行为绝望模型、大鼠OBX模型和大鼠慢性束缚(chronic restraint stress，CRS)模型研究远志提取物的抗抑郁药效及作用机制。 本研究的主要内容如下: 1嗅球切除大鼠代谢组学及自噬状态研究 Sprague-Dawley大鼠麻醉后，采用吸除嗅球的方式建立OBX大鼠模型。术后恢复2周，灌胃给予大鼠氟西汀(10 mg/kg)，14天后收集大鼠24h尿液，并进行行为学评价，包括空场检测、高架十字迷宫检测、强迫游泳检测(forced swimming test，FST)、高情绪行为评价和Moms水迷宫检测。行为学检测结束后处死动物，收集大鼠前额叶皮层(prefrontal cortex，PFC)和海马组织，利用液相色谱-质谱联用技术检测大鼠PFC中色氨酸相关代谢物和神经递质的水平;同时采用UPLC-QTOF-MS技术对收集的大鼠尿液和海马进行代谢组学分析;采用Westernblot方法检测大鼠海马和PFC中AMPK-mTOR信号通路蛋白和自噬相关蛋白的表达。 结果显示，OBX大鼠表现出显著的高活性和高情绪反应，在FST中的不动时间显著增加，在水迷宫检测中表现出学习记忆能力降低，氟西汀能逆转OBX大鼠的抑郁样行为，但不能改善其空间学习记忆能力的缺失。OBX大鼠PFC中色氨酸、5-羟吲哚乙酸和多巴胺水平升高，而犬尿氨酸和5-羟色胺水平显著降低，氟西汀能逆转OBX大鼠PFC中犬尿氨酸、5-羟色胺和5-羟吲哚乙酸的含量变化。代谢组学研究结果显示，OBX大鼠尿液和海马代谢物轮廓与假手术组相比发生明显的分离。通过多元数据分析，在大鼠尿液和海马中分别鉴定到26个和16个差异代谢物作为潜在的生物标志物。这些差异代谢物的改变主要涉及氨基酸代谢、能量代谢、肠道菌群代谢、嘌呤代谢和抗坏血酸和醛糖二酸代谢等通路的紊乱，氟西汀能部分逆转这些代谢物的异常。另外，OBX大鼠海马和PFC中感受能量状态的AMPK-mTOR信号通路异常，自噬受到抑制，氟西汀可恢复AMPK-mTOR通路的正常功能，提高自噬水平。 2远志提取物抗抑郁药效研究 采用小鼠行为绝望模型、大鼠OBX模型和大鼠CRS模型，通过多种行为学检测评价远志提取物的抗抑郁药效。结果显示，远志提取物(0.5和1g/kg)灌胃给药14天，可显著减少ICR小鼠在FST中的不动时间;远志提取物(0.5和1g/kg)灌胃给药28天能明显缓解OBX模型大鼠的抑郁样行为，减少OBX大鼠在高架十字迷宫中的开臂停留时间和运动总路程，降低OBX大鼠的高情绪评分和空场运动活性，缩短OBX大鼠在FST中的不动时间;远志提取物(0.5和1g/kg)灌胃给药28天能提高CRS大鼠的糖水偏爱指数，缩短CRS大鼠在新奇抑制摄食检测中的摄食潜伏期和在FST中的不动时间，增加CRS大鼠的空场运动路程，但对CRS大鼠的体重降低和在高架十字迷宫中的焦虑样行为没有明显的改善作用。 3远志提取物抗抑郁作用机制研究 采用Westernblot、免疫荧光染色、透射电镜和RT-qPCR技术研究远志提取物的抗抑郁作用机制。结果显示，远志提取物可提高行为绝望模型小鼠大脑皮层、OBX大鼠和CRS大鼠PFC中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和beclin1的表达，减少p62的水平，从而促进自噬的发生。远志提取物能使OBX大鼠和CRS大鼠PFC中紊乱的AMPK-mTOR信号通路恢复正常，抑制Akt、mTOR和ULK1的过度磷酸化，并提高p-AMPK的水平。OBX和CRS导致大鼠PFC中小胶质细胞激活，活化NLRP3炎性小体，提高炎症相关因子NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-αmRNA的相对水平;远志提取物可抑制OBX大鼠和CRS大鼠PFC中小胶质细胞的过度活化，减少NLRP3炎性小体的激活，降低炎症相关因子的mRNA水平。此外，远志提取物还能改善抑郁模型大鼠星形胶质细胞和神经元的损伤，提高GFAP、NeuN和PSD95的蛋白表达水平。 综上，代谢组学研究表明OBX导致大鼠尿液和海马代谢物发生显著改变，主要涉及氨基酸代谢和能量代谢等通路的紊乱，鉴定的生物标志物可有助于了解抑郁症的发病机制，并为抑郁症的诊断提供参考;远志提取物能够通过纠正AMPK-mTOR信号的异常、提高自噬水平、抑制过度的神经炎症反应和提高神经可塑性，逆转行为绝望模型、OBX模型和CRS模型动物的抑郁样行为，发挥显著的抗抑郁作用。
抑郁症;代谢组学;嗅球切除;慢性束缚;远志提取物
中国医学科学院北京协和医学院
博士
生药学
常琪
2020
中文
R749.4;R285.5
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）