CXCR4拮抗多肽及其与化疗药共载纳米胶束对难治性急性髓系白血病的治疗作用及机制研究
急性髓系白血病(Acute Myeloid leukemia，AML)占成年人急性白血病的80％左右。现行AML治疗多采用以阿糖胞苷为基础的联合化疗方案，完全缓解率在70％左右。但是，化疗药物的攻击会使AML细胞上调某些耐药相关蛋白的表达，降低细胞对化疗药物的敏感性，同时还引导细胞向骨髓、脾脏等基质细胞丰富的组织器官趋化归巢，在其中形成微小残留病灶，导致患者易耐药和复发，三年内的复发率高达50％-60％。化疗药物普遍缺乏靶向性，会带来严重的毒副作用，老年患者对于化疗的耐受尤其差;而复发或难治性AML患者对化疗不再敏感，也难以再从化疗中受益。此外，AML细胞遗传学异常复杂，涉及数千种基因突变，针对基因突变的靶向药物的研发充满挑战，迄今进入临床的数量极为有限。目前国际上AML的五年总生存率仅为25％左右，因此，迫切需要研发更为有效的新技术和新治疗手段。 已有研究表明，多种类型的AML细胞表面会表达某些共同的耐药相关抗原，成为AML治疗和药物研发的靶标蛋白，趋化因子受体CXCR4是其中一种。CXCR4高表达的AML细胞可通过与配体CXCL12相互作用，归巢到骨髓微环境中，从中获得增殖和耐药信号;同时，在CXCL12的招募下，向脾脏和肝脏等器官中浸润。临床上已明确CXCR4高表达与AML患者的不良预后密切相关。目前有若干CXCR4拮抗剂在临床Ⅰ期或Ⅱ期研究阶段，尚未获批用于AML治疗。我们实验室前期根据CXCR4的序列特征自主研发了一种新的化学合成CXCR4拮抗多肽(E5)，可有效干扰多种人源AML细胞系的CXCR4/CXCL12生物轴，抑制细胞的迁移和粘附，并在急性早幼粒白血病异种移植瘤小鼠模型中表现出良好的抗肿瘤效果。 基于以上背景，本课题的研究思路与目标是将CXCR4拮抗多肽E5与两亲性磷脂大分子培化磷脂酰乙醇胺(Distearoylphosphoethanolamine-PEG，简称DSPE)组装成负载E5的胶束(命名为M-E5)，一方面提高其在溶液中的稳定性，以期在难治性白血病小鼠模型上获得更好的拮抗治疗效果;同时，将其作为靶向CXCR4的药物递送平台，将化疗药盐酸阿霉素(Doxorubicinhydrochloride，简称Dox)负载到M-E5中，提高难治性AML小鼠的化疗效果。 本文制备了两种胶束:首先，利用涡旋混合、超声和55℃加热等，制备得到了负载CXCR4拮抗多肽E5的胶束(M-E5)。在此基础上，将Dox引入到M-E5中，制备出负载E5和Dox且载药比例可调的胶束(M-E5-Dox)。采用透射电子显微镜、原子力显微镜及动态光散射等方法对上述两种胶束的粒径、表面电势及形貌进行了表征。结果表明，E5可单独或与Dox共同负载到DSPE胶束上。M-E5和M-E5-Dox两种胶束均呈尺寸均一的球形，在5％的葡萄糖溶液或生理缓冲液中稳定分散。 用半致死剂量的X射线辐照C57小鼠4h后，通过尾静脉注射来自濒死AML1-ETO(AE)&C-KITD816V小鼠的脾脏细胞，建立了难治性AML小鼠模型。抗体竞争性结合性实验的结果表明，M-E5可与CXCR4的胞外N端结合;迁移实验结果表明，M-E5有效阻止了CXCL12介导的脾脏和骨髓AML细胞的迁移。体内定植实验的结果显示，M-E5皮下给药24h后，脾脏和骨髓中AML细胞的比例显著降低。此外，M-E5能动员AML细胞进入外周血循环，在皮下给药后2h达到最佳效果。 免疫原性实验结果表明，M-E5免疫原性较低，长时间多次皮下注射未诱导机体产生IgG和IgA抗体。对AML小鼠给予皮下注射M-E5治疗后，小鼠外周血、脾脏及骨髓中的AML细胞比例均显著降低;与此同时，外周血中的白细胞数也显著减少。转录组测序分析结果显示，经M-E5治疗后，小鼠AML细胞中上调的基因显著富集到与凋亡和分化相关的生物学过程，而下调的基因显著富集到增殖和粘附相关的生物学过程。通过荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、免疫组化和流式细胞术对测序分析的结果予以验证，结果显示，脾脏和骨髓AML细胞中与凋亡相关的基因Caspase8和Endog、凋亡蛋白Cleaved-Caspase3以及分化标志物CD11b和Gr-1的表达显著升高，表明M-E5主要通过诱导AML细胞发生分化和凋亡产生抗肿瘤效果。给予皮下注射10mg/kgM-E5治疗后，AML小鼠的中位生存期显著延长。此外，当M-E5与化疗药组合高三尖杉酯碱和盐酸阿霉素联合应用时，可显著提高化疗的效果。 此外，M-E5-Dox能够将更多的Dox递送到对盐酸阿霉素耐药的HL60细胞(HL60/A)中，有效增加Dox在该耐药株内的积累，产生了更强的细胞毒性。在难治性AML小鼠模型上，连续4天腹腔注射M-E5-Dox后，在停药第6天，AML小鼠外周血、脾脏、骨髓及肝脏中的AML细胞比例显著降低。与此同时，与各对照治疗组相比，M-E5-Dox组小鼠的中位生存期显著延长。Westernblot的分析结果表明，M-E5-Dox使脾脏组织中CXCR4/CXCL12轴下游信号蛋白Erk和p-38的磷酸化水平以及抗凋亡蛋白Mcl-1和CXCR4的表达水平显著降低，因而抗AML的效果显著增强。 综上所述，M-E5作为单药可通过拮抗CXCR4/CXCL12生物轴，有效抑制AML细胞在脾脏和骨髓中的定植、动员AML细胞到外周血循环，显著降低外周血、脾脏及骨髓中AML细胞的负荷，延长难治性AE&C-KITD816V小鼠的生存期;也可与化疗药组合(柔红霉素和高三尖杉酯碱)联合应用，增强化疗效果。此外，共载药纳米胶束M-E5-Dox同时具有CXCR4靶向性、CXCR4拮抗功能和Dox的杀伤作用，三者联合作用，有效增强了对AE&C-KITD816V小鼠的治疗效果。
急性髓系白血病;CXCR4;M-E5;盐酸阿霉素;纳米胶束;药物运载
中国医学科学院北京协和医学院
博士
生物医学工程
许海燕
2020
中文
R733.71
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）