肿瘤再生细胞逃逸CTL杀伤的力学机制探讨
目的:当前以PD-1、CART细胞为代表的免疫细胞疗法在临床肿瘤治疗中大获成功，然而依旧有一部分患者出现复发。这提醒我们，肿瘤细胞中存在一群细胞可以通过某些机制逃避T细胞杀伤。穿孔素和颗粒酶代表T细胞杀伤肿瘤细胞的核心手段，迄今为止肿瘤细胞如何逃避穿孔素打孔这一关键免疫机理仍不清楚。同时，穿孔素在细胞膜表面形成孔洞的结构和形态仍未被真正地观察到。实验室前期研究结果表明，具有干性的肿瘤再生细胞(tumor-repopulating cells，TRC)具有较软的物理性征。基于此，本项目拟阐明穿孔素在肿瘤细胞膜表面穿孔的力学机理和真实的孔洞结构，回答具有干性的肿瘤细胞利用自身物理特性实现免疫逃避的基本机制;同时借助此力学原理，探究联合细胞硬度剂如增强细胞骨架药物，发展新型免疫联合疗法，提升肿瘤免疫疗法效果。 方法:我们利用肿瘤特异性的杀伤性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)和肿瘤细胞共培养后，通过流式细胞仪检测CTL对肿瘤细胞的杀伤效率;同时使用纯化的穿孔素处理分化的肿瘤细胞和TRC，通过流式细胞仪、共聚焦荧光显微镜检测打孔情况;和原子力显微镜(Atomic Force Microscope，AFM)观察细胞膜表面孔洞的真实结构和形态，并对穿孔素所成孔洞的大小、深度和数目进行测量统计;使用原子力显微镜检测细胞的软硬度;使用化学药物或采用基因编辑技术敲除或过表达Cdc42蛋白，影响细胞骨架蛋白从而改变细胞软硬度，探究对穿孔素打孔的影响;采用免疫共沉淀、蛋白质电泳以及质谱分析方法，鉴定出肿瘤细胞表面与穿孔素可能相互作用的蛋白;进一步利用CRISPR/Cas9技术，验证缺失该蛋白后，穿孔素打孔过程和细胞软硬度是否受到影响;使用生物膜层干涉技术(Bio-layer Interferometry，BLI)证明穿孔素与肿瘤细胞膜分子存在相互作用;构建小鼠荷瘤模型，同时给予体外过继CTL和细胞硬度剂治疗，从体内水平证实于性肿瘤细胞利用柔软性逃逸T细胞杀伤，而使用细胞骨架硬度剂可以逆转此现象;收集临床黑色素瘤和结肠癌患者肿瘤组织，分析肿瘤组织内存在柔软的干性肿瘤细胞无法被T细胞杀伤是临床治疗复发的重要原因。 结果:(1)柔软的TRC可以逃逸CTL的杀伤。我们将OVA-B16细胞与OT-1CD8+T细胞共培养，发现无论将T细胞比例提高到多少，总有一小群肿瘤细胞不能被杀死，这群细胞最后被鉴定为TRC，且细胞软硬度明显低于可以被杀死的分化肿瘤细胞。同时TRC的柔软性为细胞本身的物理特性，与细胞周期、细胞培养环境、细胞密度无关。(2)穿孔素无法在TRC细胞表面有效打孔。为了验证TRC是通过影响穿孔素打孔过程来逃逸CTL杀伤，我们体外分离纯化了穿孔素蛋白，并使用等量的穿孔素处理分化的肿瘤细胞和TRC，发现TRC会阻碍穿孔素有效成孔。(3)细胞软硬度会影响穿孔素的成孔能力。由于细胞软硬度是由细胞骨架蛋白所决定的，因此我们使用细胞骨架蛋白抑制剂或硬化剂处理细胞，改变细胞的软硬度，观察穿孔素在细胞膜表面的打孔情况。同时我们采用基因编辑技术敲除或过表达Cdc42蛋白，影响细胞骨架蛋白F-actin的生成过程，探究对穿孔素打孔的影响。(4)穿孔素在细胞膜表面打孔需要MYH9。进一步，我们采用免疫共沉淀、蛋白质电泳以及质谱分析方法，鉴定出肿瘤细胞表面与穿孔素可能相互作用的蛋白，发现MYH9可能与穿孔素存在相互作用。进一步通过基因编辑技术，发现缺失该蛋白后，穿孔素打孔过程受阻，同时对细胞软硬度产生影响。(5)MYH9蛋白会影响穿孔素钻孔力的产生及大小。我们进一步探讨MYH9对于穿孔素打孔力的产生与传导是如何影响的，以及穿孔素在细胞膜表面打孔的力是如何与细胞软硬度相关联的。实验结果显示，MYH9介导钻孔力产生的过程，同时可以将穿孔素在细胞膜表面产生的钻孔力传递给F-actin，传递至F-actin的数量决定着钻孔力的大小。(6)小鼠肿瘤模型体内实验证实柔软的干性肿瘤细胞可以逃逸CTL杀伤。我们构建小鼠黑色素瘤模型和结肠癌模型，体外过继特异性CTL治疗，发现干性肿瘤细胞不能被杀死。当我们使用细胞硬度剂给予小鼠治疗后，肿瘤生长明显受阻，生存期明显增长。同时，将细胞硬度剂联合PD-1中和抗体，治疗效果最为明显，证实增加肿瘤细胞硬度可以提高T细胞免疫治疗效果。(7)进一步验证接受临床治疗的肿瘤患者组织内存在柔软的干性肿瘤细胞无法被T细胞杀伤，是临床治疗复发的重要原因。 结论:具有干性的TRC可以利用自身柔软的物理特性，通过阻碍穿孔素在细胞膜表面的成孔过程，来逃逸CTL的杀伤，该过程是通过MYH9蛋白所介导的;而增强TRC的硬度，使得穿孔素有效打孔，从而逆转肿瘤细胞免疫逃逸。同时将细胞骨架硬度剂与肿瘤免疫治疗(PD-1中和抗体)相联合，可以有效地增强特异性CTL抗肿瘤免疫反应，提供治疗效果，为肿瘤免疫与增强肿瘤细胞硬度的交叉治疗提供新思路。
肿瘤再生细胞;穿孔素;细胞软硬度;原子力显微镜;生物机械力
中国医学科学院北京协和医学院
博士
免疫学
黄波
2020
中文
R730.3
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）