转录下调的miR--4306和基因组扩增的lncRNA--712在三阴性乳腺癌发生发展中的作用机制研究
三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是一种特殊类型的乳腺癌亚型，指雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)，人的表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)均为阴性的乳腺癌，约占所有乳腺癌的15％～20％。三阴性乳腺癌具有发病年龄早、恶性程度高、治疗手段少等特点。因其对内分泌治疗及分子靶向治疗不敏感，化疗是目前主要的治疗方法。但三阴性乳腺癌易发生化疗耐药，导致化疗无效、肿瘤复发，其转移和死亡风险较其他亚型乳腺癌更高。三阴性乳腺癌发生发展及耐药机制尚不明确，这也极大的阻碍了其分子靶向治疗和化疗药物的研究进程。因此，阐明三阴性乳腺癌发生发展及耐药的分子机制，成为乳腺癌研究的热点。 非编码RNA(non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA。在过去，非编码RNA被认为是基因组中的“垃圾RNA”，近年来，随着基因组学和生物学信息学的发展，特别是高通量测序技术的兴起，人们发现非编码RNA在众多生命活动和疾病中发挥重要的作用。非编码RNA参与肿瘤发生发展的各个阶段，研究非编码RNA在肿瘤中作用的分子机制，不仅可从新的角度认识肿瘤的发病机理，也可为肿瘤的诊断与治疗拓展了新方向。 本论文的第一部分以miR-4306为研究对象，研究转录下调的miR-4306在三阴性乳腺癌发生发展和治疗中的作用及分子机制。非编码小RNA(microRNA，miRNA)广泛存在于真核生物中，参与生物体各种生理和病理过程。它高度保守，表达具有组织特异性，在组织和血中稳定性高，分子量小，检测手段灵活方便，易制成核酸药物，是极具临床应用潜力的肿瘤诊断标志物和治疗靶点。 雌激素受体与孕激素受体都是类固醇激素受体，它们作为转录因子诱导特定基因转录表达，影响靶细胞的生命活动。人的表皮生长因子受体2最为人熟知的功能是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，但也有研究表明，它可入核发挥转录因子的作用。目前，已有很多针对microRNA参与三阴性乳腺癌发生发展的研究，但是否存在某个/些microRNA，可同时被上述三个因子转录调控，并且由于这三个因子的缺失，导致其在三阴性乳腺癌中特异性的低表达，从而参与三阴性乳腺癌恶性进展的过程，尚不明确。 在本研究中，我们首先利用microRNA芯片结合生物信息学分析，筛选可能同时被ER、PR、HER2调控的非编码小RNA;利用双荧光素酶报告基因实验，DNA免疫共沉淀等实验验证了miR-4306可被ER、PR、HER2转录调控。因此，ER、PR、HER2在三阴性乳腺癌中的缺失是miR-4306特异性低表达的主要原因。 我们在325例乳腺癌组织和配对癌旁组织中检测miR-4306的表达，结果显示miR-4306在乳腺癌组织中的表达显著低于癌旁组织，且其在三阴性乳腺癌组织中的表达显著低于luminal型和HER过表达型乳腺癌组织。分析miR-4306的表达与临床资料的相关性，结果显示，miR-4306的表达与三阴性乳腺癌患者的淋巴结转移和不良预后负相关。 细胞功能实验表明，miR-4306抑制三阴性乳腺癌恶性表型的形成(特别是与转移密切相关的淋巴管和血管的生成)，同时，miR-4306可促进顺铂诱导的三阴性乳腺癌细胞凋亡。裸鼠相关的动物实验表明，miR-4306抑制三阴性乳腺癌的生长、淋巴结转移和肺转移。鸡胚尿囊膜实验结果显示，miR-4306可明显抑制微血管生成。 分子机制研究发现，miR-4306可通过靶向SIX1影响VEGFC的表达，从而抑制淋巴管的生成和淋巴内皮细胞的迁移，最终导致肿瘤的淋巴结转移;可通过靶向SIX1、Cdc42影响它们下游基因CyclinD1、E-caherin等的变化，从而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移;可通过靶向血管生成因子VEGFA抑制血管生成。 综上所述，miR-4306有望成为三阴性乳腺癌的治疗靶点。三阴性乳腺癌患者虽易发生化疗耐药，但对铂类药物较为敏感，可选择有顺铂、卡铂药物的化疗方案。我们构建了三阴性乳腺癌的原位模型，利用经过特殊化学修饰的miR-4306激动剂联合顺铂治疗三阴性乳腺癌，显著地提高了抗肿瘤治疗效率。miR-4306联合顺铂靶向治疗为三阴性乳腺癌的个体化治疗提供了新方案。 本论文的第二部分以长链非编码RNAlncRNA-712为研究对象，研究因基因扩增而在三阴性乳腺癌中异常高表达的lncRNA-712诱导三阴性乳腺癌自噬和转移的分子机制。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是指长度大于200nt，不具备蛋白编码能力的RNA，可从表观修饰、转录和转录后等水平参与基因的调控与修饰。长链非编码RNA广泛参与多种生理及病理过程，近年来研究表明，IncRNA与肿瘤的发生、发展及化疗敏感性密切相关，可作为肿瘤的诊断标志物和治疗靶点。 在本研究中，我们首先通过lncRNA芯片结合TCGA数据库中的拷贝数扩增数据筛选在三阴性乳腺癌中异常高表达的lncRNAs，结果表明，lncRNA-712、lncRNA-836、lncRNA-246基因所在区域在三阴性乳腺癌基因组中明显扩增。我们进一步选择在三阴性乳腺癌基因组扩增最明显的lncRNA-712进行后续研究。 在125例乳腺癌组织和配对的癌旁组织中检测lncRNA-712的表达，结果显示，lncRNA-712在三阴性乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且其表达水平与淋巴结转移和不良预后正相关;lncRNA-712在lumina1型和HER2过表达型乳腺癌组织中的表达与其在配对癌旁组织中的表达并无明显差别。 通过RACE实验鉴定了lncRNA-712在乳腺癌中的全长为1108nt。核浆分提实验表明LncRNA-712在细胞核和细胞浆均有分布。细胞功能实验显示，LncRNA-712促进三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移以及自噬。 蛋白芯片筛选与lncRNA-712特异性结合的蛋白，并对这些蛋白进行KEGGpathway富集分析，富集到细胞自噬相关的吞噬小体形成的信号通路。在这些蛋白中，吞噬小体形成相关的VPS34和USP14与lncRNA-712结合的评分也很高。RNA免疫共沉淀、RNApulldown实验验证了lncRNA-712与自噬相关蛋白VPS34和USP14的结合。进一步机制研究发现，lncRNA-712通过结合USP14增加其蛋白稳定性，导致去泛素化酶USP14的下游分子Beclin1表达上调，引发细胞自噬;lncRNA-712通过结合VPS34抑制其乙酰化，增强其脂激酶活性，引发细胞自噬;lncRNA-712可被外泌体包裹，释放至正常乳腺上皮，诱发正常乳腺上皮细胞发生自噬。 以上研究表明，lncRNA-712在三阴性乳腺癌中的表达异常上调，可通过结合并调控自噬相关蛋白USP14和VPS34诱发细胞自噬，进而促进三阴性乳腺癌的恶性进程。我们后续将进一步完善lncRNA-712在三阴性乳腺癌中诱导自噬和转移的具体分子机制，并针对lncRNA-712进行药物筛选，利用类器官模型和PDX模型探讨针对lncRNA-712的药物在三阴性乳腺癌中的作用，期待为三阴性乳腺癌转移的分子机制和治疗方案提供新思路。
三阴性乳腺癌;miR-4306;lncRNA-712;肿瘤转移;表皮生长因子受体
中国医学科学院北京协和医学院
博士
细胞生物学
宋咏梅
2020
中文
R737.9
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）