ATF6调控下游基因CTH影响肝癌进程的分子机制研究
研究背景:肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的癌症之一，在2018年占新增癌症病例总数的4.7％，是导致癌症死亡的第三大原因。虽然有大量关于HCC的研究，然而其预后存活率仍然很低。内质网(ER)是调控蛋白质进行折叠修饰的重要细胞器，很多环境、生理和病理损伤因素会干扰内质网的蛋白折叠，从而触发内质网应激(ER stress)，进而发生未折叠蛋白反应(UPR)。肿瘤的发生发展需要增加蛋白质合成与折叠，肿瘤细胞更容易发生ERstress反应。而UPR可以增强蛋白质折叠能力，以满足增加的蛋白质合成的需求，促进细胞存活，增殖，转移有利于癌细胞的生长，使癌细胞适应不良环境或是癌症治疗。转录活化因子6(ATF6)是UPR下游信号通路转导分子之一，可作为转录因子与内质网应激反应元件(ERSE)结合，促进下游靶基因转录，来调节内质网的稳态。本课题组之前曾报道ATF6基因多态性与HCC易感性相关，主要是通过增加ATF6及其下游基因的mRNA表达来实现，提示ATF6可能参与调控HCC发生发展。 近年来有研究表明硫化氢(H2S)可调节癌细胞生长和肿瘤发生过程。在肝细胞内，胱硫醚-γ-裂解酶(CTH)是一个主要的内源性产生H2S的酶，H2S作为第三种气体信号分子在许多生理和病理过程中都发挥着重要作用。许多研究表明异常激活的CTH/H2S信号通路与癌症发生发展密切相关。 本研究旨在阐明ATF6调控HCC发展的分子机制，为HCC治疗提供潜在的治疗靶点。 实验方法:通过MTT细胞活性实验、transwell迁移、侵袭、集落形成以及westernblot实验研究ATF6对于肝癌细胞系的影响;利用ATF6肝特异性敲除鼠探究ATF6对于小鼠肝癌发生的影响;利用转录物组测序信息结合qPCR筛选ATF6下游基因;通过启动子双荧光素酶报告基因实验、ChIP、EMSA实验确定ATF6结合下游基因的作用位点;通过MTT细胞活性实验、transwell迁移、侵袭、集落形成以及westernblot实验研究ATF6下游基因-CTH对于肝癌细胞系的影响;利用亚甲基蓝方法检测CTH对于H2S生成的影响;westernblot检测CTH对于细胞自噬的影响;利用改良的生物素转换实验检测CTH对于Keap1巯基化的影响;CoIP实验检测CTH对Keap1-Nrf2相互作用的影响;裸鼠成瘤实验检测CTH对于移植瘤生长的影响;免疫组织化学检测ATF6、CTH、p62、Nrf2在肝癌患者组化切片中的表达。 研究结果:ATF6促进肝癌细胞迁移、侵袭、生长和上皮间质转化。与对照组相比，ATF6肝特异性敲除鼠肝脏肿瘤生长较少;通过转录物组测序信息结合qPCR筛选出ATF6下游基因-CTH，并在mRNA与蛋白水平上验证;探究ATF6调控CTH的机制，确定ATF6结合CTH启动子的特定序列—tg和ccaat;CTH促进肝癌细胞迁移、侵袭、生长、上皮间质转化以及H2S生成;CTH以及H2S抑制肝癌细胞发生自噬;CTH促进Keap1巯基化修饰，位点为151位半胱氨酸，进一步促进了Nrf2进入细胞核从而激活mTORC1信号通路;CTH可加速HCC生长，ATF6/CTH信号通路预示肝癌进展。 研究结论:ATF6调控下游基因CTH影响肝癌发展。ATF6通过与CTH启动子tg和ccaat位点结合促进CTH表达水平;CTH催化生成的H2S对Keap1的151位半胱氨酸进行巯基化修饰;巯基化Keap1与Nrf2解离，激活mTORC1信号通路，最终抑制自噬，加速肝癌的进展。
肝细胞癌;ATF6;胱硫醚-γ-裂解酶;硫化氢;巯基化修饰
中国医学科学院北京协和医学院
博士
生物化学与分子生物学
刘英
2020
中文
R735.7
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）