人脂肪间充质干细胞来源的外泌体通过抑制小胶质细胞/巨噬细胞活化促进创伤性脑损伤大鼠神经功能的恢复
研究背景: 创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury，TBI)是45岁以下，年轻个体死亡和残疾的主要原因，幸存的患者可能出现认知和记忆缺陷，视力和听力的丧失，运动功能障碍以及各种心理问题。TBI还是慢性神经退行性病变(如阿尔兹海默病，帕金森病等)的已知风险因素。然而迄今为止，在临床上TBI仍缺乏有效的治疗措施。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一种成体多能干细胞，来源于中胚层，具有多向分化和自我更新的能力，且免疫源性低，目前被认为是治疗损伤性疾病比较理想的干细胞。许多动物实验研究表明MSCs可显著改善TBI后神经功能障碍，其主要机制可能是通过旁分泌多种细胞因子发挥治疗作用，而并非细胞替代效应，间充干细胞来源的外泌体(exosomes)可能介导了主要的治疗作用。最新的研究证据表明，MSCs来源的exosomes可通过减轻损伤组织的炎性反应，降低功能细胞的凋亡，促进组织再生和血管新生，改善多种疾病的病理过程，而且与MSCs相比，exosomes治疗不存在栓塞和免疫排斥的风险，且便于批量化生产，易于存储，更加安全，故用exosomes替代MSCs治疗TBI将是一种更加安全而有效的治疗手段。 研究目的: 研究人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSC)来源的外泌体(hADSC-ex)对TBI的治疗作用及其潜在的机制。 研究方法: 通过Feeney自由落体法构建大鼠TBI模型，损伤后24小时，进行对侧脑室注射hADSC，hADSC-ex或磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered saline，PBS)。通过改良大鼠神经功能缺损评分(Modified Neurological Severity Scores，mNSS)和前肢踩空试验(Footfault test)，评估治疗后感觉运动功能的恢复;定量PCR和ELISAs检测受损脑组织和脑脊液中炎症因子的表达;CD68免疫组织化染色检测损伤灶周边区域小胶质/巨噬细胞的浸润;Tunel-NeuN免疫荧光染色检测损伤灶周边区域神经元凋亡;Brdu-NeuN和Brdu-GFAP免疫荧光染色检测海马齿状回(dentate gyrus，DG)神经再生和损伤灶周边区域星形胶质细胞增殖。侧脑室注射DiR标记的hADSC-ex(DiR-hADSC-ex)后，通过小动物活体成像仪观察DiR-hADSC-ex的迁移和生物分布。侧脑室注射DiI标记的hADSC-ex(DiI-hADSC-ex)后，对大鼠脑冠状切片和分离的神经细胞，进行IBA1或CD11b(小胶质细胞)，GFAP(星形胶质细胞)，NeuN或MAP2(神经元)和MBP(少突胶质细胞)神经细胞标记物的免疫荧光染色，以确定DiI-hADSC-ex在体内的细胞摄取。原代混合神经细胞与DiI-hADSC-ex共孵育24小时，通过Cytation5细胞成像仪检测每种神经细胞中DiI荧光强度随时间的变化。最后，在原代小胶质细胞LPS+IFN-γ诱导炎症模型中，hADSC-ex共孵育处理12小时后，通过定量PCR检测M1(促炎表型)相关因子的表达，Westerblot检测NF-κB和p38MAPK信号通路亚基磷酸化水平的改变，免疫荧光检测p65亚基的核转位。 研究结果: TBI后24小时，侧脑室注射hADSC-ex，促进大鼠感觉运动功能的恢复，降低受损脑组织和脑脊液促炎因子的表达，减少损伤灶周边区域小胶质细胞/巨噬细胞浸润和神经元凋亡，促进神经再生和星形胶质细胞增殖，且治疗效果与hADSC相当。同时，体内连续荧光成像显示，DiR-hADSC-ex在对侧脑室注射后，DiR荧光信号逐渐向病变区域富集。大鼠脑冠状切片和分离的神经细胞免疫荧光染色结果显示，DiI荧光信号主要与IBA1或CD11b阳性的小胶质细胞/巨噬细胞有明显的重叠。在原代混合神经细胞中，DiI荧光信号显著地富集于小胶质细胞。在原代小胶质细胞LPS+IFN-γ诱导炎症模型中，hADSC-ex抑制了M1相关因子的表达，降低了p65，IKKα/β，IKBα和p38亚基的磷酸化水平和p65亚基的核转位。 研究结论: hADSC-ex脑室注射后优先被小胶质细胞/巨噬细胞摄取，并通过NF-κB和p38-MAPK信号通路抑制其在损伤过程中的活化，减轻神经炎症反应，从而改善损伤微环境，促进神经功能恢复。
创伤性脑损伤;间充质干细胞;外泌体;小胶质细胞;神经再生
中国医学科学院北京协和医学院
博士
细胞生物学
赵春华
2020
中文
R651.15
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）