CAR T细胞治疗通过焦亡机制触发细胞因子风暴
目的:细胞过继免疫治疗(Adoptive T cell transfer, ACT)又称为细胞治疗，即通过基因修饰，把自体T细胞改造为能够识别肿瘤抗原的特异性T细胞，回输给机体后杀伤肿瘤细胞的免疫疗法，已经在治疗血液瘤方面取得突破性进展。但是，作为一种药物，就会有它的副反应，CART细胞疗法也不例外。而其中最常见的就是炎症因子风暴，也就是炎症因子释放综合征(Cytokine release syndrome，CRS)，严重时可致死，是CART细胞治疗最常见的致死原因。尽管CRS阻碍了CART细胞疗法的应用，但目前为止，临床上仍然没有很好的预测标记物，并且诱导CRS发生的内在机制依然不明确。因此，深入研究CRS发病机制显得尤为重要且急切。 方法:首先，构建靶向于人CD19分子的CART(CD 19-CAR T)细胞，与患者原代肿瘤细胞或表达CD19的Raji或NALM-6共孵育，拍照观察杀伤过程并检测Cellviability,LDH以及PI的阳性比例，同时用Westernblotting检测从分子层面来确定靶细胞焦亡(Pyroptosis)。其次，通过CRISPR/Cas9技术敲除，点突变或恢复GSDME表达者等手段来证实GSDME在CART细胞诱导靶细胞焦亡中的作用。再通过抑制或者沉默Caspase-3，穿孔素(Perforin，PRF1)或颗粒酶B(GranzymeB，GZMB)来探寻CART细胞引起肿瘤细胞焦亡的通路。再者，构建鼠CART细胞靶向于人CD19(hCD19-mCAR T)或HER2(hHER2-mCAR T)分子以及B16细胞过表达人CD19(CD19-B16)或HER2(HER2-B 16)分子并共孵育，再与特异性杀伤以及排斥反应杀伤比较，探究鼠CART细胞杀伤靶细胞时释放的鼠穿孔素(Perforin，Prf1)和鼠颗粒酶B(Granzyme B，Gzmb)的量与其他杀伤反应之间的区别;并通过体外加入纯化的Prf1/Gzmb来探讨其在引起靶细胞焦亡中的作用。构建含有不同共刺激信号的鼠CART细胞分别与CD19-B16或HER2-B16共孵育，研究共刺激信号在促进CART细胞诱导靶细胞焦亡中的作用。第四，分离培养正常人外周血单核巨噬细胞，取CART细胞与野生型(Wild type，WT)或者敲除GSDME的靶细胞共孵育的上清刺激巨噬细胞，检测巨噬细胞上清中炎症因子IL-1β和IL-6的变化。取CART细胞处理后的上清处理WT,Caspase-1或GSDMD基因敲除的和NLRP3沉默的THP-1细胞，检测上清中炎症因子IL-1β和IL-6的改变。同时检测CART细胞杀伤后释放到上清中的损伤分子ATP，HMGB1和HSP70。最后建立CART细胞治疗白血病小鼠引起严重CRS反应的动物模型，比较接种野生型或者GSDME敲除株小鼠严重CRS的发生率，死亡率以及相应炎症因子的改变。并通过抑制CASP1，ATP及其受体或清除单核巨噬细胞等手段来检测CRS的改变。 结果:1.CART细胞引起靶细胞焦亡而非凋亡。原代肿瘤细胞与CD19-CART细胞共孵育后拍照发现靶细胞胞膜肿胀，膜上吹出深色小泡，Cellviability降低，LDH和PI阳性比例升高。在CD19-CART细胞与Raji或NALM-6细胞系以及HER2-CART细胞与MCF-7或SGC-7901细胞系共孵育后也得到同样的结果。2.GSDME介导CART细胞诱导靶细胞焦亡。GSDME而非GSDMD广泛表达，CART细胞与靶细胞作用后引起靶细胞GSDME活化，而非GSDMD或MLKL;敲除或者点突变GSDME基因后，靶细胞由焦亡转向凋亡，恢复GSDME表达后靶细胞又能进入焦亡。3.CART细胞通过Perforin/GranzymeB/Caspase-3通路诱导靶细胞焦亡。CART细胞与靶细胞作用后能引起Caspase-3剪切;抑制Caspase-3，GZMB或者沉默GZMB，PRF1后均能阻断CART细胞诱导的肿瘤细胞焦亡。4.CART细胞超强亲和力以及共刺激信号是诱导靶细胞焦亡的关键因素。与OT-IT细胞介导特异性杀伤以及体外排斥反应相比，只有CART细胞能引起明显的靶细胞焦亡;同时CART细胞与靶细胞相互作用后释放Prf1/Gzmb的量，引起靶细胞内Caspase-3的活化均明显多于特异性杀伤和排斥反应。而沉默Prf1或Gzmb后均能阻断T细胞杀伤作用。共培养结果显示线性连接的共刺激信号能显著增强CART细胞杀伤并诱导靶细胞焦亡。5.靶细胞焦亡释放的损伤因子能强烈刺激巨噬细胞释放炎症因子。CART细胞与靶细胞共孵育上清能刺激单核巨噬细胞活化，释放炎症因子IL-1β和IL-6，而特异性杀伤上清则未能活化巨噬细胞释放炎症因子;Western结果显示敲除靶细胞GSDME能降低巨噬细胞内Caspase-1活化和GSDMD剪切，而敲除Caspase-1或GSDMD也能显著降低炎症因子释放。进一步检测发现CART细胞与靶细胞共孵育上清中ATP和HMGB1显著升高，降解ATP或者抑制巨噬细胞上ATP受体均能显著抑制巨噬细胞活化，减少炎症因子释放，而敲除HMGB1也能显著抑制IL-6的分泌。6.GSDME介导的大量肿瘤细胞焦亡是CART治疗引起CRS的内在原因。敲除靶细胞GSDME基因后发现小鼠体内炎症因子显著降低，体温升高也不明显，同时因严重CRS引起的死亡率也显著降低。降解ATP或者抑制ATP受体也能显著降低小鼠CRS发生率及严重程度，同样的结果在抑制Caspase-1或者清除小鼠体内巨噬细胞后获得，而重建野生型巨噬细胞系统后小鼠重新出现严重CRS，但用Caspase-1或者GSDMD敲除鼠的巨噬细胞进行重建则不会出现同样的现象。分析病人血浆中LDH和ATP后发现与病人CRS严重程度正相关，同时分析发现白血病原代细胞中GSDME表达与患者CRS严重程度正相关。 结论:1.CART细胞引起靶细胞焦亡而非凋亡;2.相比于特异性T细胞，CART细胞能释放更多的PRF1/GZMB，引起靶细胞内过量的Caspase-3活化，进而剪切GSDME引起靶细胞焦亡;3.大量肿瘤细胞焦亡，释放内容物如ATP和HMGB1，引起巨噬细胞活化并释放大量炎症因子，诱导CRS发生。4.白血病细胞GSDME的表达水平以可以作为预测CART治疗引起严重CRS发生的标记物。
CART细胞;炎症因子释放综合征;GSDME;焦亡
中国医学科学院北京协和医学院
博士
免疫学
黄波
2020
中文
R730.51
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）