衰老人脑海马组织神经新生相关标志物的染色方法及表达研究
研究背景:成体海马神经新生(Adult Hippocampal Neurogenesis，AHN)可在学习、记忆、情绪调节中发挥作用，该领域的研究对于治疗衰老相关的神经退行性疾病如阿尔茨海默病具有一定前景，但衰老人群是否存在成体海马神经新生仍有争议，普遍使用的标本处理流程及标志物染色研究方法均需进行优化。 研究目的:1、探究利用脑库标本进行神经干细胞标志物免疫荧光染色的实验流程，及对脑库取材流程的优化;2、利用脑库标本探究常见神经新生标志物在海马齿状回的表达情况。 研究方法:使用国家发育和功能人脑资源库来源的标本，进行遗体海马组织取材、固定、脱水包埋、冰冻切片、免疫荧光染色及免疫组化染色操作，探究不同保存方式、使用不同固定液处理、抗原修复方法、免疫荧光染色流程、苏丹黑淬灭等方法对于提高等成片质量和染色阳性率的影响，并使用DCX、SOX2、Nestin等人脑海马新生研究常用标志物和新的潜在标志物ASCL1进行海马齿状回免疫荧光染色，观察其表达分布及阳性细胞的形态、大小等特征。 研究结果:取材后立即使用4％PFA固定6小时，梯度蔗糖脱水后冰冻，所得到的组织结构完整性最佳，根据不同标志物使用不同缓冲液作为介质进行热抗原修复可以提高阳性率，染色前硼氢化钠孵育和染色后苏丹黑孵育可以降低非特异荧光和自发荧光，得到更好的观察效果。衰老人脑海马齿状回的颗粒层、颗粒下区、分子层均可观察到大量SOX2阳性细胞核呈不同形态的DCX阳性细胞，少数DCX阳性细胞与SOX2共标，或与成熟神经元标志物NeuN共标。齿状回的颗粒层、颗粒下区可见Nestin阳性细胞，根据形态可分为多个亚型，胞内均可见脂褐素。Ascl1阳性细胞分为高表达和低表达，其中在核中高表达Ascl1的细胞绝大多数为SOX2阴性，反之亦然，提示Ascl1与SOX2存在相互作用关系。 研究结论:在认知功能正常的衰老人脑海马齿状回中仍可检测到神经新生相关标志物表达阳性的细胞，单一标志物阳性细胞均具有形态上的异质性，提示存在不同功能的细胞亚群。利用免疫荧光染色的方式对脑库标本进行海马神经新生标志物研究的难度较高，本研究探究出一系列标本处理与染色过程的优化方案，可最大限度保持组织结构完整性及抗原性，降低自发荧光和非特异荧光。
海马神经新生;神经干细胞;免疫荧光染色
中国医学科学院北京协和医学院
博士
临床医学
马超
2020
中文
R339.38
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）