益生菌通过影响自噬保护肠黏膜屏障的机制研究
第一部分婴儿双歧杆菌及嗜酸乳杆菌的黏膜屏障保护功能 目的:在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎小鼠模型中探究婴儿双歧杆菌(B.infantis)对肠黏膜屏障的保护作用。在脂多糖(LPS)刺激HCT116细胞模型中探究B.infantis和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)对机械屏障的影响。 方法:1.6-8周龄雄性C57BL/6小鼠分为正常对照组、DSS建模组和DSS+B.infantis灌胃组，每组4-5只。除正常对照组外，均予2.5％DSS饮用5天后正常饮用水2天。同时第1天起，予正常对照组、DSS建模组蒸馏水灌胃7天，DSS+B.infantis灌胃组予B.infantis灌胃7天。通过体重、疾病活动度指数、结肠长度、结肠组织HE染色炎症病理评分评估小鼠一般情况和肠道炎症情况;通过Westernblot评估机械屏障蛋白的表达水平。2.将HCT116细胞分为对照组、LPS刺激组、LPS+B.infantis共培养组、LPS+L.acidophilus共培养组。通过Westernblot检测机械屏障蛋白的表达水平，通过测定单层细胞通透性评估屏障功能，通过划痕实验评估细胞的划痕愈合能力。 结果:1.与正常对照组小鼠相比，给予B.infantis灌胃的小鼠第7日DAI评分显著降低(p=0.0037)，结肠长度显著增长(p=0.0208)，炎症病理评分显著降低(p=0.0008)。Westernblot结果显示，DSS建模组小鼠ZO-1、Occludin、E-cadherin、Claudin-1表达水平降低，给予B.infantis灌胃后上述蛋白表达水平显著回升。2.LPS刺激可以使ZO-1和Occludin的表达量下降，与B.infantis或L.acidophilus共培养能够使上述蛋白表达量轻度升高。LPS刺激导致单层细胞通透性升高(p=0.0135)，HCT116细胞与B.infantis或L.acidophilus共培养能够使单层细胞通透性维持在较低水平(前者p=0.0524，后者p=0.0092)。与B.infantis或L.acidophilus共培养能够促进细胞的划痕愈合能力(24h时前者p=0.0056，后者p=0.0092)。 结论:1.B.infantis能够有效降低DSS急性结肠炎模型中小鼠的结肠炎症水平，促进上皮间连接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin、Claudin-1的表达。2.HCT116细胞与B.infantis或L.acidophilus共培养，可以在LPS刺激下促进ZO-1和Occludin的表达，降低单层细胞通透性，并促进细胞的划痕修复能力。 第二部分丁酸通过诱导自噬促进Claudin-2降解保护紧密连接 目的:探究丁酸钠通过影响细胞自噬调控紧密连接蛋白Claudin-2的机制。 方法:通过Westernblot及免疫荧光染色检测丁酸对细胞自噬水平的影响以及同时伴随的紧密连接蛋白变化。通过自噬抑制剂及蛋白酶体抑制剂处理细胞，探究自噬在丁酸诱导的Claudin-2降解中的作用。通过免疫荧光染色观察Claudin-2在丁酸处理后表达及分布的变化。 结果:丁酸可以使LC3-Ⅱ比例升高，p62减少，Atg5-Atg12复合体表达量升高，提示丁酸可以诱导细胞自噬，同时伴随Claudin-2水平的降低。用自噬抑制剂氯喹处理细胞后，可以抑制Claudin-2的降解，但用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞不能抑制Claudin-2的降解。免疫荧光结果表明，用丁酸刺激后可以导致细胞膜上Claudin-2减少，向胞浆中移位，与溶酶体的共定位增多。 结论:丁酸可以诱导细胞自噬。丁酸可以促进Claudin-2从细胞膜转移至胞浆中。丁酸可以促进Claudin-2经自噬的降解。
肠黏膜屏障;益生菌;细胞自噬;丁酸
中国医学科学院北京协和医学院
博士
临床医学
李景南
2020
中文
R574
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）