卵巢癌人源肿瘤异种移植模型的建立、鉴定与铂化疗药效观察
研究背景 上皮性卵巢癌(EOC)是死亡率最高的女性生殖系统肿瘤，超过70％的患者在诊断时已经进入临床晚期，经过规范的一线手术与化疗，70％的患者在3年内肿瘤复发，晚期病例5年生存率仅为29％。基于动物模型的临床前研究可为筛选卵巢癌药物、优化临床用药方案提供理论支持。传统肿瘤模型使用体外持续传代的细胞系，在分子和细胞水平均与临床肿瘤差距较大，应用此模型筛选出的有效药物在人体中的有效性不足5％。人源性组织异种移植(PDX)模型是一种将肿瘤患者的肿瘤组织移植至重度免疫缺陷型小鼠(如NSG品系)体内，并使肿瘤组织在小鼠体内生长而构建成的一种肿瘤模型。PDX模型将肿瘤组织直接移植到NSG小鼠体内，尽可能保留了亲代肿瘤生长的微环境，例如肿瘤细胞周围浸润的淋巴细胞、细胞外基质、微血管等，完好的表现了亲代肿瘤性状，维持了肿瘤的异质性，是现阶段最优秀的肿瘤动物模型。但部分研究者也发现二者存在的差异。目前多种类型的肿瘤均成功建立PDX模型，对于EOC，不同研究中PDX模型建模成功率差距较大，影响移植成瘤的因素尚未明确。卵巢癌PDX模型能否替代临床卵巢癌组织进行肿瘤机制研究及抗肿瘤药物实验，现有研究对此也缺乏充分、有效的阐述。本研究建立了EOC-PDX模型，从多个角度验证了卵巢癌PDX模型与临床肿瘤的一致性，并对模型在药效试验中的应用价值进行了初步评估，为PDX模型在临床前研究中的合理应用奠定了基础。此外，本研究探究移植成瘤的影响因素，有助于进一步提高成瘤率，建立更稳定、高效的卵巢癌PDX模型。 研究方法 1.卵巢癌PDX模型的建立 (1)收集在北京协和医院行肿瘤细胞减灭术的EOC患者的新鲜肿瘤样本，移植至NOD-Prkdc-Il2rg(NPI)免疫缺陷小鼠侧腹皮下，建立卵巢癌PDX模型。使用流式细胞学技术检测移植瘤中CD19和CD45表达水平以除外淋巴瘤。 2.卵巢癌PDX模型的鉴定 (1)卵巢癌PDX模型进行石蜡病理切片，将HE染色结果与原代肿瘤对比，在组织细胞水平验证PDX模型与原代肿瘤的一致性; (2)选取高级别浆液性卵巢癌PDX模型，对病理切片进行PAX-8、CK7、CK20、P16、P53、WT-1、ER、PR免疫组化染色，在蛋白质水平比较PDX模型与原代肿瘤的一致性。 (3)对卵巢癌原代肿瘤和PDX模型肿瘤配对样本进行全外显子测序和转录组测序，在分子遗传学水平比较PDX模型与原代肿瘤的一致性。 3.卵巢癌PDX模型成瘤影响因素分析 统计卵巢癌患者的临床及病理信息，通过多因素回归模型分析各项临床病理特征与PDX模型成瘤率的关系。对原代肿瘤样本进行全外显子测序，在基因层面探究成瘤率的影响因素。 4.卵巢癌PDX模型铂化疗药效观察 通过移植传代扩大卵巢癌PDX模型数量后，在模型上进行铂类药物为基础的药效试验，将临床患者化疗结局和对应PDX模型化疗缓解情况进行一致性分析，评估卵巢癌PDX模型药效试验对临床患者化疗疗效的预测价值。 研究结果 1.卵巢癌PDX模型的建立 本研究入组了北京协和医院2018年1月至2019年10月诊治的113例Ⅱ-Ⅳ期EOC患者，在肿瘤细胞减灭术中收集新鲜肿瘤样本，离体12小时内移植至免疫缺陷小鼠皮下，成功建立69位卵巢癌患者的PDX模型，P0代成瘤率61.1％，中位成瘤时间176天，通常在移植后4-8月内成瘤。通过标记CD19和CD45的流式细胞分析结果表明，移植过程中淋巴瘤率形成率处于较低水平。将成功建立的P0代模型进行传代，P1代成瘤率高达96.7％，并且成瘤周期明显缩短(p＜0.001)。 2.卵巢癌PDX模型的鉴定 (1)HE染色结果显示，PDX模型较好地还原了原代肿瘤的组织形态学特征，同时观察到PDX模型中肿瘤间质成分减少，肿瘤细胞发生富集; (2)免疫组化结果显示10例高级别浆液性癌的PDX模型中，PAX-8、CK7、CK20、P16、P53、WT-1、ER、PR蛋白表达水平与原代肿瘤的一致性系数为0.698，提示一致性较好; (3)对10例高级别浆液性卵巢癌患者肿瘤与对应模型肿瘤样本分别进行全外显子测序，发现PDX模型较好地保留了原代卵巢癌的高频突变基因、杂合性缺失模式以及Signature1(与自发脱氨产生内源性点突变相关)与Signature3(与DNA双链断裂后同源重组修复程序错误)两类重要突变特征;PDX模型与原代肿瘤拷贝数变异趋势一致，但前者基因组更不稳定，拷贝数变异程度更大。9对高级别浆液性癌配对样本的mRNA测序结果显示，PDX模型和原代肿瘤的转录组可能存在一定差异，移植成瘤将对肿瘤细胞的转录模式产生影响。 3.卵巢癌PDX模型成瘤影响因素分析 统计分析患者的临床病理特征，Logistic多因素回归模型结果显示，新辅助化疗是成瘤率的独立影响因素(OR=0.315，p=0.006);而患者年龄、是否是复发病例、卵巢癌病理类型、分级与分期、术前CA125水平、TP53与BRCA1/2基因突变情况、移植位点数均不影响PDX模型的建立。进一步分析新辅助化疗对成瘤的影响，发现肿瘤Ki-67指数越高，成瘤率越高，而新辅助化疗显著降低了卵巢癌Ki-67指数。通过对38例卵巢癌原代肿瘤进行全外显子测序，发现新辅助化疗可导致肿瘤基因组杂合性缺失频率降低(p=0.014)，而杂合性缺失频率明确与成瘤率相关(p=0.024);而肿瘤突变负荷、单碱基突变类型、微卫星不稳定性与成瘤结果不相关，也不受新辅助化疗的影响。 4.卵巢癌PDX模型铂化疗药效观察 本研究在31例患者卵巢癌样本建立的P1、P2代PDX模型上进行了以顺铂或卡铂为主的药效实验，利用改良的实体瘤的疗效评价标准(mRECIST)评价PDX模型的化疗疗效，发现PDX模型铂化疗的完全缓解率(60.6％)与临床患者铂敏感率(68.0％)具有良好的一致性(Kappa=0.655，p=0.001)，卵巢癌PDX模型可以较准确地预测临床患者的铂敏感性。完全缓解的PDX模型对应的卵巢癌患者比未获得完全缓解的PDX模型对应的患者有更长的无进展生存期(p=0.0111)。 结论 1.EOC在NPI小鼠中有较好的成瘤性，PDX模型P0代成瘤率为61.1％，但成瘤周期较长。传代后成瘤率增加、成瘤周期缩短。 2.卵巢癌PDX模型与临床肿瘤在组织细胞学水平、蛋白质水平和基因组水平均显示出较好的一致性，PDX模型完整地保留了原代卵巢癌的组织细胞类型与分子遗传特征。 3.新辅助化疗降低了肿瘤组织的Ki-67指数、降低肿瘤基因组杂合性缺失频率，从而导致移植成瘤率降低，应避免使用新辅助化疗后的肿瘤进行移植建模。 4.PDX模型的铂药效试验结果与临床卵巢癌患者的铂敏感性具有良好的一致性，模型显示完全缓解的病例有更长的PFS，PDX模型对患者预后有预测价值。
卵巢上皮癌;动物模型;人源肿瘤异种移植;第二代测序;铂类药物;临床疗效
中国医学科学院北京协和医学院
博士
临床医学
潘凌亚
2020
中文
R737.31
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）