继发性肾脏近端小管损伤的临床特点及危险因素研究
研究背景 药物肾毒性是急慢性肾功能不全的重要原因，其中肾脏近端小管主动分泌或重吸收药物(及其代谢产物)，是肾损伤的主要部位。近端小管损伤可表现为功能障碍，即电解质和小分子物质重吸收障碍，临床表现为完全和不完全范可尼综合征，损伤严重时甚至发生细胞凋亡或坏死，是急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)最重要的原因。而肾小管损伤与修复过程中，不仅再现发育的过程，还和肾小球(管球反馈)、不同节段的小管之间发生相互协调和作用，决定肾脏最终的结局。研究药物近端小管损伤特点和机制，不仅有助于理解药物近端小管损伤修复的共同机制，也是探究小管之间，及其与小球之间相互作用的重要窗口，但因为临床样本量和研究手段的限制，国内外关于药物相关范可尼综合征的研究并不多。如最常见导致近端小管损伤的抗病毒药物富马酸替诺福韦酯(Tenofovir disoproxil fumarate，TDF)肾毒性，缺乏大样本中国人群临床资料，肾小管功能障碍与肾小球滤过率(Glomerular filtration rate，GFR)之间的关系并不明确;临床观察到长期口服噻嗪类利尿剂阻断远端小管钠氯共转运蛋白(Na+-Cl-cotransporter，NCC)后，对近端小管功能的影响，但缺乏相应的机制研究。 本研究首先观察TDF治疗人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染患者队列中近端小管损伤的临床特点，探索近端小管和肾小球滤过功能的相关性，进而在体外细胞实验中观察转运子损伤和内质网应激的关系;最后在噻嗪类利尿剂作用位点远端小管NCC功能障碍的Gitelman综合征(Gitelman syndrome，GS)患者队列中总结近端小管功能的临床特点，评估肾小球储备功能，分析可能的病理生理机制。 研究目的 1.观察接受TDF治疗的HIV感染患者的近端小管损伤和肾小球滤过功能损伤的特点，分析小管功能损伤与GFR之间的关系; 2.体外培养近端小管上皮细胞，观察替诺福韦(Tenofovir，TFV)损害不同转运子功能，及其与内质网应激的关系; 3.分析GS队列中近端小管功能改变及肾小球储备功能特点，探讨远端小管功能障碍影响近端小管功能、肾小球储备功能的可能机制。 研究方法 第一部分替诺福韦损伤肾脏近端小管的临床特点和可能机制 1.替诺福韦治疗HIV感染患者的肾脏损伤特点 纳入2001年9月1日至2019年8月31日在北京协和医院就诊、规律随访、接受TDF治疗的HIV感染患者。收集基线和随访的临床资料。定义近端小管损伤为满足低磷血症、低尿酸血症、低二氧化碳结合力、尿糖阳性、尿蛋白阳性中的2项及以上。定义肾功能快速恶化为估算肾小球滤过率(Evaluated glomerular filtration rate，eGFR)年下降率超过5ml/min/1.73m2。总结该队列中近端小管损伤、肾功能损伤的发生比例和临床特点，分析二者之间的相关关系。 2.替诺福韦损伤近端小管与内质网应激之间的关系 培养人近端小管上皮细胞系(HK2)，通过倒置相差显微镜观察细胞形态，免疫荧光染色鉴定HK2特异性标志物(细胞角蛋白CK18、Megalin)，以及特定转运子(钠糖共转运子SGLT2、钠磷转运子NaPi-Ⅱa、尿酸盐阴离子转运体URAT1)。使用CCK8细胞增殖实验检测不同TFV浓度和作用时间对HK2细胞存活率的影响，选择合适的TFV浓度和时间刺激HK2细胞，利用免疫荧光染色半定量方法评估TFV对转运子、内质网应激标志物GRP78/BiP的影响。 第二部分Gitelman综合征患者肾脏近端小管功能改变 纳入2005年8月1日至2019年12月31日在北京协和医院就诊、基因确诊为GS的患者，同时选取性别年龄匹配的健康对照。对SLC12A3基因一代测序为单杂合突变的患者，进一步行全外显子组测序明确基因突变情况。收集人口学信息、症状、血尿化验检查等临床资料。氢氯噻嗪试验通过计算口服氢氯噻嗪前后尿氯离子排泄分数的变化量，评估患者NCC功能。总结患者钙磷代谢、尿酸代谢特点。同时建立蛋白负荷试验方法，通过计算口服高蛋白饮食前后GFR的变化量，评估患者肾小球储备功能。 研究结果 第一部分替诺福韦损伤肾脏近端小管的临床特点和可能机制 1.共纳入接受TDF治疗的HIV感染患者375例，男性为主(占90.1％)，平均随访时长为37.9±26.1月，最长达116月。近端小管损伤的比例为6.7％，其中最常见临床表现是蛋白尿(20.3％)和低磷血症(12.3％)。近端小管损伤与低体重显著相关，而与年龄、TDF疗程、基线病毒载量、基线CD4+T淋巴细胞计数等无显著相关性。 2.有完整血肌酐随访的患者共373例，随访结束时的eGFR较基线显著下降(104.6±15.2比110.6±14.2ml/min/1.73m2;P＜0.001)，eGFR年下降率平均为5.0±22.7ml/min/1.73m2，其中23.6％的患者eGFR年下降率超过5ml/min/1.73m2。女性与高eGFR年下降率显著相关。 3.细胞实验:贴壁HK2细胞呈卵圆形或多边形，部分融合分布呈铺路石样。HK2细胞特异性标志物CK18、Megalin免疫荧光染色阳性，提示为近端小管上皮细胞。近端小管转运子SGLT2、URAT1、NaPi-Ⅱa免疫荧光染色阳性，提示HK2细胞正常表达该转运子。细胞增殖毒性检测中，TFV刺激时间为24h时，所检测TFV浓度梯度范围内细胞存活率均大于95％。刺激时间为48h时，2.5μmol/L的TFV浓度下，细胞存活率小于95％。TFV(1μmol/L)干预肾小管上皮细胞48h后，转运子(SGLT2、URAT1、NaPi-Ⅱa)表达均显著降低，而内质网应激标志物GRP78/BiP表达无显著性差异。 第二部分:Gitelman综合征患者肾脏近端小管功能改变 1.共纳入基因确诊GS患者125例，33例(26.4％)患者SLC12A3基因一代测序为单杂合突变。25例患者完成了全外显子组测序，9例(36％)患者最终确诊为复合杂合突变，全外测序新检出7个突变位点，包括3种错义突变、1种剪接位点突变、3种内含子突变。 2.与健康对照相比，GS患者血钙水平更高，尿钙、血镁、甲状旁腺素、25羟基维生素D水平更低，血磷无显著差异。血镁水平越低，甲状旁腺素水平也越低。离子钙水平低与代谢性碱中毒相关。 3.GS患者血尿酸显著高于健康对照。男性、女性中高尿酸血症比例分别为19.4％和34.5％。高尿酸血症组患者尿酸排泄分数显著低于血尿酸正常患者。 4.共4例GS患者完成了蛋白负荷试验，肌酐清除率法计算平均肾小球储备功能为66.7±21.5ml/min/1.73m2，肌酐联合胱抑素C法计算平均肾小球储备功能为12.1±4.4ml/min/1.73m2，与健康对照均无显著性差异。 结论 在本研究条件下: 1.TDF治疗的HIV感染患者中，6.7％出现近端小管损伤，23.6％肾功能年下降率超过5ml/min/1.73m2。近端小管转运子功能损伤与eGFR年下降率无显著相关性。 2.TFV下调近端小管上皮细胞转运子(SGLT2、URAT1、NaPi-Ⅱa)表达。 3.GS患者中，尿钙低、血总钙高、高尿酸高，与近端小管功能代偿相关。
近端肾小管损伤;替诺福韦;Gitelman综合征;储备功能;钠氯共转运蛋白
中国医学科学院北京协和医学院
博士
临床医学
陈丽萌;吕玮
2020
中文
R692
2021-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）