牙胚间充质中持续激活Wnt/β--catenin信号通路抑制牙胚发育的机制探究
背景:牙齿的发育是颅神经嵴来源的间充质细胞与外胚层来源的上皮细胞相互作用的结果。多种信号通路在上皮与间充质之间传递信号，协同调控牙胚的起始、形态发生与细胞分化，主要包括BMP、FGF、Shh与Wnt信号通路。其中Wnt家族已知包括19个成员，根据胞内信号转导途径不同，Wnt信号通路被分为经典Wnt信号通路与非经典Wnt信号通路。经典Wnt信号通路的激活依赖胞质中β-catenin起作用，故又称为Wnt/β-catenin信号通路，非经典Wnt信号通路的激活不依赖于β-catenin，包括平面细胞极性途径（JNK途径）与Ca2+途径。在牙齿发育的过程中，Wnt/β-catenin信号通路仅在牙胚上皮组织中激活并决定了牙胚的起始位置与形态发生，但牙胚间充质中Wnt/β-catenin信号通路对牙胚发育的作用尚不明晰。特异性敲除牙胚间充质中Wnt/β-catenin信号通路导致部分牙胚发育停留在蕾状期或帽状早期，提示Wnt/β-catenin信号通路虽然在牙胚间充质中不激活，但它对于牙胚的正常发育不可或缺。 目的:本研究通过Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f乓验小鼠，在小鼠牙胚间充质中持续激活Wnt/β-catenin信号通路，探究牙胚间充质中Wnt/β-catenin信号通路对牙胚发育的影响与作用机制。 方法:(1)免疫组化法检测Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠牙胚间充质中Wnt/β-catenin信号通路效应器Lef1与负反馈抑制剂Axin2的表达;(2)组织切片与染色观察Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠牙胚形态学变化;(3)BrdU标记法与TUNEL法检测Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠牙胚间充质细胞的增殖与凋亡水平;(4)原位杂交实验检测Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠牙胚间充质中成牙基因的表达情况;(5)EGFP小鼠牙胚间充质细胞与WT小鼠牙胚间充质细胞共同培养对比观察矿化能力;(6)茜素红染色观察WT小鼠切牙间充质细胞与磨牙间充质细胞的成骨矿化能力;(7)体外组织重组观察Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠牙胚间充质的成牙能力; 结果:(1)免疫组织化学结果显示:与WT小鼠相比，Wnt/β-catenin信号通路负反馈抑制剂Axin2在Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠的表达范围扩大到切牙与磨牙间充质甚至腭板与下颌间充质中。Wnt/β-catenin通路下游转录因子Lef1的表达范围也从邻近上皮的间充质中扩大到腭板与下颌间充质中，说明Wnt/β-catenin信号通路在Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠牙胚间充质中被激活。(2)组织学观察发现:E14.5Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠下颌切牙胚发育停留在蕾状期，而磨牙胚与WT小鼠磨牙胚相比体积较小。E16.5Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠上颌切牙胚表现为杂乱的骨样组织与角化组织，下颌切牙胚完全消失;约有50％的Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠失去磨牙胚，其余50％磨牙胚与WT小鼠相比体积较小。(3)BrdU标记结果显示:E13.5Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠上颌磨牙间充质细胞增殖数基本同野生型小鼠(p＞0.05);下颌切牙与下颌磨牙间充质细胞增殖数同WT小鼠相比减少(p＜0.01);上颌切牙间充质细胞增殖数较WT小鼠明显减少(p＜0.05)。(4)TUNEL结果显示:E13.5天Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠上、下颌切牙间充质中TUNEL阳性细胞数略有增加，而上、下颌磨牙间充质中TUNEL阳性细胞数与WT小鼠基本相同，说明Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠牙胚形态发育异常的原因包括牙胚间充质细胞增殖减少。(5)原位杂交结果显示:E14.5，Fgf3在Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠上、下颌切牙间充质中表达缺失，在上、下颌磨牙间充质中表达下降;Runx2在Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠上颌切牙间充质中表达缺失，在上、下颌磨牙间充质中表达增强;Msx1在Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠下颌切牙间充质中表达缺失，在上颌切牙、上颌磨牙与下颌磨牙间充质中表达下降。说明Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠牙胚间充质中持续激活Wnt/β-catenin通路导致牙胚间充质中成牙基因表达下降而成骨基因表达增加。(6)茜素红染色结果显示，WT小鼠切牙间充质细胞经过成骨诱导后钙化结节数明显多于WT小鼠磨牙间充质细胞。EGFP荧光小鼠切牙胚间充质与WT小鼠磨牙胚间充质细胞共同体外培养后观察发现，矿化部位与切牙间充质细胞位置保持一致，磨牙间充质细胞缺少矿化组织或矿化不完全呈云雾状，说明切牙间充质细胞矿化能力强于磨牙间充质细胞。(7)组织重组实验发现:E13.5Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠磨牙胚细胞重组后无法形成牙齿，且E13.5Osr2-creKI;Ctnnb1ex3f小鼠磨牙间充质与E10.或E13.5WT小鼠牙上皮重组后仅形成骨与角化组织，说明牙胚间充质中持续激活Wnt/β-catenin信号通路不仅抑制牙胚间充质的成牙能力，同时抑制了具有成牙潜能的牙上皮的诱导作用。 结论:牙胚间充质中持续激活Wnt/β-catenin信号通路使间充质细胞增殖减少，同时牙胚间充质中成牙基因表达降低而成骨基因表达增加，导致牙胚间充质成牙能力下降，无法诱导非牙源性上皮形成牙齿，也抑制了具有成牙潜能的牙源性上皮的诱导作用。
牙胚发育;牙胚间充质细胞;信号通路;细胞增殖;基因表达
大连医科大学
硕士
口腔基础医学
肖晶
2020
中文
R780.2
2021-05-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）