黄柏碱对α--葡萄糖苷酶和胰岛素抵抗糖脂代谢的影响及机制
目的： 1.通过研究黄柏碱对-α葡萄糖苷酶的体外抑制作用、作用方式以及作用分子机制，探讨降糖中药黄柏中主要成分之一黄柏碱通过抑制α-葡萄糖苷酶活性降低餐后血糖的可能性。 2.通过建立胰岛素抵抗(IR)HepG2细胞模型，研究黄柏碱对IR-HepG2细胞糖脂代谢紊乱状态的改善作用，并通过考察其对IR-HepG2细胞IRS-I/PI3K/Akt胰岛素信号通路的干预作用来探讨黄柏碱改善HepG2细胞胰岛素抵抗状态可能的作用机制，为后续探讨黄柏碱的体内降糖作用提供实验基础。 方法： 1.建立α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选模型，以对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，阿卡波糖为阳性对照，研究黄柏碱对a-葡萄糖苷酶活性的抑制率，采用动力学方法研究黄柏碱的酶抑制作用类型，并采用同源建模的方法构建a-葡萄糖苷酶的三维结构，运用分子对接技术分析黄柏碱抑制α-葡萄糖苷酶的潜在分子作用机制。 2.MTT法检测不同剂量黄柏碱(6.20、12.5、25、50、100、200、400u M)给药48h对HepG2细胞的细胞毒性。 3.采用1mM棕榈酸联合2mM油酸诱导IR-HepG2细胞模型，用葡萄糖氧化酶法检测下同剂量黄柏碱(6.20、12.5、25、50、lOOμM)分别处理IR-HepG2细胞12、24和48h后对培养液中葡萄糖的消耗量。 4.MTT法检测不同剂量小檗碱(6.20、12.5、25、50、100、200、400μM)给药24h对HepG2细胞的细胞毒性。 5.采用葡萄糖氧化酶法检测不同剂量小檗碱(6.25、12.5、25、50、100μM)处理IR-HepG2细胞24h后对培养液中葡萄糖的消耗量。 6.采用甘油三酯(TG)、胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒分别测定黄柏碱低、中、高剂量组(20、50、100μM)处理IR-HepG2细胞24h后TG、TCH、LDL-C和HDL-C的含量，并设置小檗碱组做对比。 7.采用RT-qPCR法检测黄柏碱低、中、高剂量组(20、50、100μM)处理IR-HepG2细胞24h后IRS-I/PI3K/Akt胰岛素信号通路INSR、IRS-1、PI3K、Akt2和GSK-313因子的mRNA表达，并设置小檗碱组做对比。 8.采用Westen-Blot法检测黄柏碱低、中、高剂量组(20、50，100u M)处理IR-HepG2细胞24h后IRS-1/PI3K/Akt胰岛素信号通路关键蛋白p-IRS-1(Ser307)、p-Akt(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)的磷酸化水平以及PI3K蛋白的表达水平，并设置小檗碱组做对比。 结果： 1.黄柏碱对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)为126.36mg.L-1，且抑制率随浓度增加而增加。酶动力学结果显示，黄柏碱浓度增大，反应速率降低，Vmax、Ka变小。分子对接结果显示，黄柏碱与α-葡萄糖苷酶位点5的结合能最低且其最好的对接构象结合能为-7.5kcal·mol-1。黄柏碱可能通过与α-葡萄糖苷酶分子中的LYS15、SER290、HIS258等氨基酸残基形成氢键，与残基ALA289形成疏水相互作用以及与残基GLUIO形成π-阴离子相互作用发挥其抑制活性。 2.黄柏碱给药剂量为6.20至100μM时，预处理48h对HepG2细胞无明显毒性作用（P＞0.005）。 3.不同剂量黄柏碱分别处理IR-HepG2细胞12h和24h后，与模型组相比，细胞对葡萄糖的消耗呈现不同程度的升高并呈剂量依赖性，其中以25、50和100μM这三个剂量组改善作用最强（P＜0.005或P＜0.01或P＜0.001）;黄柏碱处理48h后，与正常组相比，模型组糖耗量无明显变化（P＞0.05），给药处理后，有些剂量组的糖耗量与模型组相比虽有稍许提升，但无显著性差异（P＞0.005）。因此，综合模型构建效果以及药物作用效果考虑，选择25、50和100μM为黄柏碱低、中、高给药剂量，24h为处理时间。小檗碱的处理时间也定为24h。 4.小檗碱给药剂量为6.20至100μM时，预处理24h对HepG2细胞无明显毒性作用(p＞0.05)。 5.不同剂量小檗碱处理IR-HepG2细胞后，与模型组相比，细胞葡萄糖消耗量均明显升高（P＜0.05或P＜0.001），综合小檗碱对HepG2细胞的毒性和促进细胞葡萄糖消耗作用考虑，选择6.20、12.5和25μM为给药剂量。 6.1mM棕榈酸联合2mM油酸诱导HepG2细胞24h后，HepG2细胞内TG、TCH和LDL-C含量明显增多（P＜0.01），HDL-C含量明显减少(P＜0.01)，黄柏碱高、中、低剂量组给药后均能显著降低IR-HepG2细胞内TG、TCH和LDL-C含量（P＜0.00或P＜0.01或P＜0.001），黄柏碱高、中剂量组能显著升高HDL-C含量（P＜0.05或P＜0.001），其中以黄柏碱高剂量(100μM)或中剂量(50μM)组的作用效果更明显，略优于小檗碱。 7.1mM棕榈酸联合2mM油酸刺激下HepG2细胞IRS-1/PI3K/Akt信号通路中关键因子INSR、IRS-1、PI3K、Akt2和GSK-3β的mRNA表达均显著下调(P＜0.00或P＜O.01)，黄柏碱给药后能上调IRS-I/PI3K/Akt胰岛素信号通路关键因子INSR、IRS-I、PI3K、Akt2和GSK-3βmRNA的表达，其中以黄柏碱高剂量(100μM)或中剂量(00μM)组的作用效果较为显著（P＜0.00或P＜0.01或P＜0.001）。 8.1mM棕榈酸联合2mM油酸刺激能显著增高HepG2细胞p-IRS-I(Ser307)蛋白的磷酸化水平(p＜0.01)，同时降低PI3K-p80蛋白的表达（P＜0.05）和p-Akt(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)蛋白的磷酸化水平（P＜0.00）。黄柏碱给药后能下调p-IRS-I(Ser307)蛋白的磷酸化水平，上调p-Akt(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)蛋白的磷酸化水平和PI3K-p85蛋白的表达水平，其中以黄柏碱高剂量组(100μM)的作用效果较为显著（P＜0.05或P＜O.01或P＜O.001）。 结论： 黄柏碱对α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，其抑制类型为可逆性的反竞争性抑制。黄柏碱的抑制作用可能主要是通过其与a-葡萄糖苷酶形成氢键、疏水作用和π-阴离子相互作用等实现的。黄柏碱对IR-HepG2细胞糖脂代谢紊乱具有改善作用，其作用机制可能与其调节IRS-l/PI3K/Akt信号通路关键因子INSR、IRS-l、PI3K、Akt2、GSK-3βmRNA的表达和p-IRS-I(Ser307)、p-Akt(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)蛋白的磷酸化水平以及PI3K-p85蛋白的表达水平相关。
黄柏碱;α-葡萄糖苷酶;胰岛素抵抗;降糖作用
广州中医药大学
硕士
药剂学
林爱华
2020
中文
R282.71;R285.5
2021-03-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）