肺炎克雷伯杆菌中吡咯喹啉醌及聚乙烯醇脱氢酶的生产与应用
一、吡咯喹啉醌(PQQ)是在细菌脱氢酶中发现的第三种氧化还原辅酶，具有抗氧化、解毒、抗癌等独特的医疗功效，属于高附加值产品。肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）能够天然生产PQQ，但其PQQ合成过程尚未完全阐明，PQQ产量尚未达到产业化生产的要求。本研究针对PQQ生产，开展了如下工作: 1、PQQ合成关键酶的确认。通过对Pqq基因簇和pq qA/B/C/D/E/F6个基因进行超表达和CRISPR干扰，确认了K.pneumoniae生产PQQ的两个关键酶pqqA和pqqB，其中pqqA是PQQ合成的前体短肽，pqqB是促进PQQ分泌到胞外的关键酶;分析超表达和抑制Pqq基因对于代谢的影响，结果发现PQQ产量与葡萄糖直接氧化途径(Glucose direct oxidative pathway，GDOP)密切相关。 2、同时超表达PQQ合成基因和增强PQQ代谢需求量提升PQQ产量。在K.pneumoniae中构建多个串联复合启动子并通过增强型绿色荧光蛋白(eGFP)进行筛选，其中诱导能力最强的是由3个tac启动子串联而成的复合启动子，用其超表达PQQ合成基因，重组菌株的PQQ产量是1个tac启动子的1.5倍（110.2nmol/L）。进而通过发酵优化提升GDOP的代谢流量，在高糖(32g/L)，低钾(0.7mM)和低pH(5.8)环境下，PQQ产量最高(363.3nmol/L)，上罐发酵54h后PQQ产量达到2371.69nmol/L，最大时空产率43.92nmol/L/h，是目前已报道K.pneumoniae中PQQ最高产量。 3、动态调节K.pneumoniae中磷酸转移酶系统(PTS)和葡萄糖直接氧化途径(GDOP)两种葡萄糖代谢途径提升PQQ产量。使用CRISPRi技术同时抑制PTS途径中的ptsG，ptsH，ptsI和ccr基因，发现抑制PTS相关基因有助于促进GDOP途径，更多的葡萄糖转变为葡萄糖酸和2-酮基葡萄糖酸，PQQ产量达到野生型的2.14倍(255.65nmol/L)，在此基础上超表达PQQ依赖性的可溶性葡萄糖脱氢酶(sGDH)，继续加强GDOP途径，PQQ产量提升到野生型的2.72倍(287.01nmol/L)，上罐发酵的产量达到2206.1nmol/L。 4、K.pneumoniae发酵上清液对小麦种子萌发和幼苗生长的影响研究。PQQ是一种生长促进因子，为了充分利用K.pneumoniae的发酵废液，实验初步研究了发酵上清液对小麦种子萌发及幼苗生长的影响，发现在小麦种子萌发和幼苗生长的不同阶段，施加适当浓度的K.pneumoniae发酵上清液能够显著改善其主要生理生化指标，提高发芽率，促进植株健壮生长。在种子萌发阶段，稀释1000倍的K.pneumoniae发酵上清液效果最好，相比水对照发芽势和发芽率分别提高了23.66％和25％。在幼苗生长阶段，稀释100倍的发酵上清液效果最好，相比水对照株高、最长根长和根茎比分别提高36.4％、68.5％和77％。 二、聚乙烯醇(PVA)是一种优良的高分子聚合物，常用于纺织、造纸等工业，也是工业废水导致环境污染的主要成分之一，酶法降解是织物退浆和PVA废水处理的重要解决方案，本研究在K.pneumoniae中超表达聚乙烯醇脱氢酶PVADH和氧化型PVA水解酶OPH，并探索了两个酶的固定化及其在PVA降解中的应用。主要工作如下: 5、在K.pneumoniae生产PQQ-PVADH和OPH。优化了PVA降解酶PVADH和OPH的密码子并在K.pneumoniae中超表达，通过辅酶再生提高PQQ的产量，发酵优化提高蛋白产量。最终，PQQ-PVADH和OPH酶活分别达到81U/mL和59.2U/mL。最重要的是，相比在大肠杆菌和毕赤酵母中生产PVADH节省了添加PQQ的成本。 6、磁球固定化PQQ-PVADH和OPH并应用于含PVA废水处理的探索。采用金属离子螯合吸附法将PQQ-PVADH和OPH固定在磁性微球的表面，单位质量的Fe3O4@IDA/Ni磁球固定上的PQQ-PVADH和OPH结合率分别达到113.9mg/g和108.36mg/g。通过Box-Behnken实验和响应面分析对双固定化酶法降解PVA的工艺条件进行了优化。在最优条件下反应10min，0.1g/LPVA的降解率为34.07％;反应30min，0.1g/L PVA降解率达到96％以上。固定化酶连续反应10批次，仍能保留90％以上的酶活。实验为将固定化酶应用于织物退浆或者PVA废水降解奠定了基础。
肺炎克雷伯杆菌;吡咯喹啉醌;聚乙烯醇脱氢酶;聚乙烯醇水解酶;生物合成;促生作用;织物退浆;废水处理
北京化工大学
博士
化学工程与技术
田平芳
2020
中文
Q814
2020-11-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）