连接亚基构建多酶催化体系的研究
多酶协同催化已经得到众多研究者的关注。多酶之间的空间位置对中间产物的传递效率有重要影响，合理地控制多酶之间的比例和距离可以提高多酶催化的效率。本论文研究连接不同多亚基酶的亚基以缩短多酶之间的距离。 本文研究了三种连接亚基的方法用来构建多酶催化体系。通过内含肽介导的亚基剪接，以肽键连接不同酶的亚基，构建了超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)双酶体系;通过多肽识别作用促进内含肽介导的亚基剪接，以肽键连接不同酶的亚基，构建了转氨酶(RTA)、丙氨酸脱氢酶(AlaDH)和甲酸脱氢酶(FDH)三酶体系。以上两种方法是通过肽键（共价键）连接不同酶的亚基构建的多酶催化体系。另外，本文研究了多肽非共价键作用连接转氨酶(RTA)和D-氨基酸氧化酶(DAAO)构建的双酶催化体系。论文取得了如下主要的结果: (1)通过内含肽介导的亚基剪接，以肽键连接不同酶的亚基。在细胞内，通过内含肽介导的亚基剪接连接不同酶的亚基构建了SOD&CAT剪接体，从而提高了反应过程中自由基的清除能力和H2O2的分解能力。圆二色光谱表明这种剪接方式对酶的二级结构影响很小，荧光光谱表明SOD&CAT剪接体的稳定性优于SOD游离酶。由于SOD&CAT剪接体中SOD亚基与CAT亚基的距离很近，从而提高了H2O2从SOD到CAT的转移速度，实现了H2O2的高效分解。SOD+CAT混合游离酶的酶活比SOD单酶高46％，SOD&CAT剪接体的酶活比SOD单酶高244％。 (2)通过多肽识别作用促进内含肽介导的亚基剪接，以肽键连接不同酶的亚基。在细胞内，通过富含亮氨酸拉链结构的异二聚体多肽的识别作用，促进内含肽介导的亚基剪接，以肽键连接不同酶的亚基，构建了RTA&AlaDH和AlaDH&FDH剪接体体系。通过BN-PAGE对连接方式进行分析，圆二色谱，荧光光谱和二维FTIR光谱提供了有关剪接酶的二级结构和稳定性的信息。基于微量热泳动技术(MST)，分析了酶与底物的相互作用。与混合酶RTA+AlaDH+FDH相比，剪接酶RTA&AlaDH+AlaDH&FDH具有更大的底物亲和力，更高的稳定性和更优的活性。 (3)通过多肽非共价键识别作用连接不同酶的亚基。RTA将氨基供体中的氨基转移到氨基受体上，催化R-构型胺转化为相应的酮，从而产生副产物D-丙氨酸。D-丙氨酸可以通过DAAO脱氨还原为丙酮酸。在细胞外通过多肽非共价键作用连接RTA和DAAO，构建了双酶RTA#DAAO体系，以实现丙酮酸→丙氨酸→丙酮酸的高效循环。通过BN-PAGE图分析了亚基RTAS和DAAOS的连接方式。RTA#DAAO中的亚基RTAS和DAAOS形成配对RTAS≈DAAOS，彼此之间的空间距离较短。而混合酶RTA+DAAO不能形成配对亚基。RTA#DAAO的转氨催化效率远高于混合酶RTA+DAAO。
多酶催化体系;亚基剪接;多肽识别作用;非共价键作用
北京化工大学
博士
化学工程与技术
冯嵬
2020
中文
TQ426.97
2020-11-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）