miRNA--149--5p和miRNA--149--3p在肝肠系统相关疾病中的作用及机理研究
异质性的肝癌和结肠炎是常见的肝肠系统疾病，严重危害人类健康。肝癌是世界死亡率第三的癌症，其中以原发性肝细胞癌(HCC)最常见。结肠炎作为免疫性肠病(IBD)的一种，是结直肠癌症发生的高风险诱因，由于其频繁复发的特点，严重降低了患者的生活质量。肝肠系统疾病的发生机制复杂，与基因和环境密切相关。目前的医疗方法对肝癌和结肠炎的治疗仍然有限。因此，对于肝肠系统疾病相关机制研究，并在此基础上探索潜在的肝癌和结肠炎治疗靶点是非常必要的。 miRNAs是具有调控功能的小分子非编码RNA，其在肝癌和结肠炎中的作用被相继报道。本研究探索了miRNA-149-5p(miR-149)和miRNA-149-3p（miR-149*）在肝肠系统疾病中的作用，包括两部分:1）miR-149*在肝癌发展中的作用及分子机制。2）miR-149和miR-149*在结肠炎发展中的作用与机制研究，并对miR-149*缺失后小鼠肠道菌群的改变与结肠炎发生之间的关系进行了论证。论文主要内容和结论如下: (1)敲除小鼠miR-149*基因（miR-149*-/-）后，检测发现内源性的miR-149和miR-149*含量同时降低。在二乙基亚硝胺(DEN)诱导急性肝损伤模型中，miR-149*-/-小鼠肝对DEN给药更敏感。肝脏中促炎基因表达升高和补偿性增殖增多表明了DEN对miR-149*-/-小鼠造成了更严重的肝损伤。在DEN诱导的肝癌模型中，miR-149*-/-小鼠的肝癌发生率比野生型(WT)小鼠更高。并且DEN处理的miR-149*-/-小鼠比WT小鼠的肝细胞表现出更强烈的补偿性增殖和更高的促炎因子表达。在miR-149*-/-小鼠体内分别补充miR-149agomir和miR-149*agomir，增加内源性miRNAs后，均能减轻DEN诱导的急性肝损伤。此外，miR-149*mimics可在体外抑制肝癌细胞Hepa1-6的增殖和迁移，且对正常肝细胞NCTC1469没有增殖抑制和炎症抑制效果。在异种移植模型中，过表达miR-149*明显抑制肝癌细胞Hepa1-6的体内成瘤进程。除此之外，基于LPS诱导的肝炎模型、DEN诱导的急性肝损伤和肝癌模型以及老年鼠模型，对miR-149*在HCC中的作用机制进行深入探索，发现miR-149*-/-小鼠肝均显示出较高的NF-κB激活信号。体外研究发现，miR-149*可抑制Hepa1-6细胞中TNF-α诱导的肝癌细胞的NF-κB信号，同时抑制LPS、TNF-α以及p65过量表达诱导的炎症响应和NF-κB转录活性。结合靶点预测与荧光素酶报告基因检测验证，发现miR-149*可以靶向抑制细胞肿瘤坏死因子受体1型相关的死亡结构域蛋白（TRADD）的表达，从而拮抗NF-κB信号通路。以上结果表明，miR-149*可通过抑制TRADD/NF-κB信号通路，作为抑癌基因来调控肝细胞癌进展，为肝癌治疗提供潜在的治疗靶点。 (2)敲除miR-149*基因后小鼠对于硫酸葡聚糖(DSS)的耐受性降低。为构建小鼠结肠癌模型，连续7天为WT小鼠和miR-149*-/-小鼠提供含2％DSS的饮用水，然后连续7天给予正常饮用水。所有miR-149*-/-小鼠均在第一个循环内死亡，WT小鼠全部存活。测定结肠炎疾病活动指数、结直肠长度和重量，以及HE染色分析发现，DSS诱导的结肠炎模型中miR-149*-/-小鼠都表现出更严重的结肠炎症状。在WT小鼠体内分别给予miR-149agomir或miR-149*agomir后，发现miR-149和miR-149*agomir均可抑制LPS诱导的结肠炎。结合体外细胞实验发现，miR-149和miR-149*均可抑制肠癌细胞Caco-2和SW480中的炎症基因表达。此外，为了揭示miR-149*-/-小鼠结肠炎易感性的分子机制，对小鼠结直肠进行蛋白分析。结果显示，与野生型(WT)小鼠相比，miR-149*-/-小鼠结直肠表现出NF-κB信号活性增强和AMPK信号活性减弱。细胞蛋白分析进一步证明miR-149*可抑制结肠癌细胞中的NF-κB信号通路并诱导AMPK信号通路。对小鼠粪便菌群进行16S rRNA测序分析发现，敲除miRNA-149*基因后改变了小鼠肠道菌群。与WT小鼠相比，miR-149*-/-小鼠肠道菌中益生菌Akkermansia菌属大幅度降低，而Bacteroides菌属和Escherichia-Shigella菌属明显升高。WT小鼠和miR-149*-/-小鼠合笼饲养后的菌群和结肠炎表型分析表明，菌群自然交换后WT小鼠菌群被miR-149*-/-小鼠肠道菌群干扰和同化，并增加了WT小鼠对DSS诱导的结肠炎的敏感性。但是使用抗生素去除肠道菌群后，miR-149*-/-小鼠的结肠炎易感性依然存在。肠道菌群研究结果表明，敲除miRNA-149*基因可以通过改变小鼠的肠道菌群促进DSS诱导结肠炎的易感性，但是miR-149*-/-小鼠的结肠炎易感性并不完全归因于肠道菌群的紊乱，在这个过程中，肠道菌群发挥了协同调控的作用。本研究表明miR-149和miR-149*抑制结肠炎发生，为结肠炎治疗提供新靶向。 本论文首次鉴定了miR-149*在肝癌中的作用，以及miR-149*和miR-149在结肠炎中的作用。研究发现miR-149*通过抑制靶点TRADD蛋白进而抑制NF-κB信号通路来抵抗肝癌。此外，本研究首次揭示了基因敲除miR-149*后小鼠肠道菌群的变化，以及肠道菌群与miR-149*-/-小鼠结肠炎易感性的关系。研究结果为治疗肝肠系统疾病提供了新治疗靶向和新思路。
肝细胞癌;结肠炎;微小核糖核酸-149-5p;微小核糖核酸-149-3p;分子机制;肠道菌群
北京化工大学
博士
化学工程与技术
王艳东
2020
中文
R735.7;R574.62
2020-11-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）