γ--内酰胺酶的发现、分子改造及固定化研究
(+)/(-)-2-氮杂双环[2，2，1]庚-5-烯-3-酮（以下简称γ-内酰胺）是重要的手性药物中间体，分别用于合成美罗利汀及抗病毒药物如阿巴卡韦和帕拉米韦。生物拆分是获得(+)-γ-内酰胺与(-)-γ-内酰胺简单、高效的方法，目前已经发现了若干个可在大肠杆菌中表达的γ-内酰胺酶，但是这些酶在应用方面具有一定的局限性，如酶活性低、对映选择性差、不稳定等。本文针对上述问题进行了研究。 利用基因组挖掘法分别在红串红球菌(Rhodococcus erythropolis N-771)和砖红色微杆菌（Microbacterium testaceum）中发现ReGL和MiteL的编码基因。将ReGL以及MiteL基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，结果表明ReGL和MiteL均具有(+)-γ-内酰胺酶活性。结合生物信息学分析和定点突变，确定了ReGL的催化三联体为K96-S171-S195，MiteL催化三联体为D9-K84-C118，具有保守的顺式肽键（I113-Q114间），并分别推测了ReGL和MiteL对γ-内酰胺的催化机理。 ReGL对(+)-γ-内酰胺的对映体选择性高，比活力为7U/mg。MiteL对(+)-γ-内酰胺比活力为185U/mg，但对映体选择性E值仅为6.3±0.2，本文重点对MiteL进行了改造，以提高其对(+)-γ-内酰胺的对映体选择性。以青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）中的异分支酸水解酶(PDB:3MCW)为模板，构建MiteL同源三维蛋白结构，将(+)-γ-内酰胺与(-)-γ-内酰胺分别对接到MiteL分子中。根据对接结果，选取底物周围5(A)以内的氨基酸为突变位点，结合饱和活性中心测试法和迭代饱和突变技术，得到多个对映体选择性提高的突变体，其中突变体ZT003(F14D/L60F/Q114R)对映体选择性E值大于200。 为了得到选择性反转的突变体即(-)-γ-内酰胺酶，本文对底物结合口袋周围的氨基酸分别构建单点、双点饱和突变体文库。经过大量的突变体筛选，发现Leu60、His51、Val86、Asn87四个氨基酸可影响MiteL对(-)-γ-内酰胺的选择性，对这四个氨基酸进行组合突变，得到对(-)-γ-内酰胺对映体选择性提高的突变体L60F/H51S，对(-)-γ-内酰胺的对映体选择性E值为3.5，为设计新型(-)-γ-内酰胺酶提供思路。本文从空间位阻和结合自由能两方面解释了突变体对(-)-γ-内酰胺对映体选择性E值提高的原因。 包封体是近几年在细菌和古生菌中发现的一类蛋白质纳米隔间，其在体内可自发组装为有序的空腔纳米结构。包封体这一特性使其成为一种绿色固定化材料。本文分别将突变体ZT003以及氧化烃微杆菌中(+)-γ-内酰胺酶突变体MhIHL-V54L与酮羟基戊二酸醛缩酶I301包封体融合表达，利用包封体自组装特性将ZT003及MhIHL-V54L固定在包封体上，实现了(+)-γ-内酰胺酶的固定化。通过透射电子显微镜、原子力显微镜、动态光散射表征了γ-内酰胺酶纳米颗粒。ZT003连接在包封体氨基端，融合表达处于纳米颗粒外围，其包封后热稳定性相较于游离ZT003有所改善。MhIHL-V54L连接在包封体羧基端，融合表达处于包封体内部。包封体为MhIHL-V54L提供了微环境，包封后MhIHL-V54L的热稳定、抗有机试剂、抗酶水解以及对高底物浓度的耐受程度相较于游离MhIHL-V54L都有明显提高，这为酶的固定化提供了一种新的方法。 总结来说，本文对酶的发现，酶的改造，以及酶固定化路线的研究，对设计工业用酶具有一定参考价值。
γ-内酰胺酶;生物拆分;分子改造;固定化技术;包封体
北京化工大学
博士
化学工程与技术
郑国钧
2020
中文
Q814
2020-11-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）