1，3--丙二醇生产菌株的改造
聚酯纤维是合成纤维的主要分支，发展十分迅速，受到行业领域的关注，我国聚酯产量为3550万吨/年，居于世界之首，1，3-丙二醇作为合成聚酯纤维PTT的单体，发展和需求空间十分巨大，而化学品l，3-PDO产量还不能达到目前市场形势和产量需求，因此寻找高效生产1，3-丙二醇的方法十分必要。合成1，3-丙二醇的方法较多，包括化学和生物法，但化学工艺具有污染大，副产物复杂且多等缺点，而生物合成法避免了以上问题，具有分支途径少，能量消耗低等优势，目前最典型成果是杜邦公司，构建重组大肠杆菌宿主菌株，以葡萄糖为底物，目标产物1，3-丙二醇的浓度能达到135g/L，这依然是目前已报道过的最高生物法浓度。 已报道借助生物法合成1，3-PDO的工艺路线有两条:一条是天然路径，借助天然菌株直接利用底物甘油生成产物1，3-PDO的工艺。研究主要针对优化发酵、分离操作和改造天然菌株，总体来说，目前以甘油为原料的目标产物1，3-丙二醇浓度一般处于60-100g/L。 除了上述天然存在的工艺外，还有利用葡萄糖为主要原料的工艺。这个工艺路线需要构建基因工程菌来实现葡萄糖生成1，3-PDO的路线。重组工程菌构建包括工艺整合和设计非天然路线两部分。第一部分是将以葡萄糖为原料生产甘油和以甘油为原料生产1，3-PDO的两个反应过程组合，实现利用葡萄糖直接转化目标产物1，3-PDO的重组菌株的构建;第二部分针对的是改造天然酶分子，使其在新条件下实现催化过程。除了杜邦公司外，其他的非甘油路线产量都较低。因此避开杜邦公司的专利保护，探究非天然途径实现1，3-PDO的高效生产十分必要。 基于对1，3-PDO合成路径的分析及相关研究方法，我们挖掘并分析了可能的葡萄糖生产1，3-PDO的新途径。经过数据库、文献查阅（分析酶学可能性）、途径模拟设计（全局代谢网络计算模型），我们可以确定最优的途径进行构建，表达系统目前选择的是大肠杆菌作为宿主菌株，优化了生产1，3-PDO的重组菌株，为后续相关聚合物聚酯的制备奠定了物质基础，本论文的主要研究结果如下: (1)在前人研究基础上，分别构建具有两种不同基因表达方式的质粒，进行表达方式的筛选。一种是单顺反子且单质粒方式，利用tac启动子和T7终止子分别对四个基因单独进行控制。另一种是多顺反子单质粒方式，利用一个T7启动子和一个T7终止子对四个基因进行控制，四个基因以RBS序列进行串联。经发酵验证36h时，前人构建宿主，单顺反子且单质粒方式和多顺反子单质粒方式的1，3-丙二醇产量最高分别为38.43mg/L，42.91mg/L和53.52mg/L，确定最优表达方式为多顺反子单质粒。 (2)以JM109-EABM菌株为基础，通过CRISPRI技术分别弱化SucD（生成琥珀酸基因，琥珀酸-辅酶A连接酶）和ldhA（生成乳酸基因，乳酸脱氢酶），得到的最优弱化菌株发酵产量最高分别达90.01mg/L和64.765mg/L，分别提高相比原始途径菌株JM109-EABM提高68.1％和21.01％。 (3)以JM109-DE3原始菌株为基础，通过Red同源重组方法分别敲除了ldhA（生成乳酸基因）和SucD（生成琥珀酸基因），构建了两株分别命名为JM109-ΔldhA和JM109-ΔSucD的菌株，并导入途径质粒pRSF-EABM，并构建JM109-ΔldhA-EABM和JM109-ΔSucD-EABM，发酵产量最高分别达127.41mg/L和57.79mg/L，相比原始途径菌株JM109-EABM提高138.1％和7.9％。 (4)以JM109-EABM菌株为基础，通过过表达不同来源醇脱氢酶yqhD（大肠杆菌来源）基因、外源导入dhaT（克雷伯氏菌来源）基因，分别构建了命名为JM109-EABM-yqhD和JM109-EABM-dhaT的两株菌，发酵产量最高分别达122.79mg/L和89.19mg/L，相比原始途径菌株JM109-EABM各提高129.4％和66.6％。 (5)以JM109-ΔldhA-EABM菌株为基础，将筛选的yqhD（大肠杆菌来源）基因过表达，将敲除乳酸与过表达yqhD组合优化，构建了命名为JM109-ΔldhA-EABM-PET-yqhD，发酵产量最高达169.31mg/L，相比原始途径菌株JM109-EABM提高216.3％。 (6)确定最优重组菌株后，筛选发酵条件，确定诱导剂浓度为0.8mM，诱导剂温度为37℃，培养基类型为TB培养基发酵培养48h，在以上条件下上罐发酵，目标产物1，3-PDO的产量达615.32mg/L。
1,3-丙二醇;天然菌株;基因改造;发酵工艺;参数优化
北京化工大学
硕士
化学工程与技术
谭天伟
2020
中文
TQ923
2020-11-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）