新型抗感染药物的发现及其分子机制研究
在人类与各种疾病的斗争中，抗感染药物的研究取得了巨大的成就，主要包括了针对细菌(及真菌)、病毒、结核、寄生虫等病原的各种药物。抗感染药物的作用靶点主要集中在病原微生物的成分上，包括病原体新陈代谢的关键分子、细胞壁的成分、生化酶、药物酶、受体分子等。其作用靶点比较单一，作用机制相对明确。而当病原微生物在不利环境中时，会发生遗传变异(如药物靶点蛋白相关基因发生变异)，病原耐药问题随之出现。病原微生物耐药也成为全球抗感染治疗的巨大挑战。抗感染药物的研究是一个持续而漫长的过程，我们需要不断地发现药物作用新靶点、新的化学骨架、并使用联合用药等，为迎接新的挑战做准备。 本研究论文主要针对抗寨卡病毒和抗结核分枝杆菌先导化合物进行了研究。分别建立抗寨卡病毒和抗结核药物筛选模型，对化合物库进行筛选，得到了具有抗寨卡病毒活性和抗结核分枝杆菌活性的先导化合物，并对其作用机制进行了研究。 第一部分:以NS5RdRp蛋白为靶点的抗寨卡病毒先导化合物研究 寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)为虫媒传播病毒，可以引起严重的神经系统并发症以及胎儿先天畸形。近年来ZIKV的大规模爆发，加剧了抗ZIKV药物研发的紧迫性。非结构蛋白(NS5)RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)是ZIKV最重要的功能蛋白之一，NS5RdRp可催化RNA链的合成，是病毒复制的关键步骤。因此，NS5RdRp是一个非常有前景的抗病毒药物研究靶点。我们以NS5RdRp蛋白为靶点进行抗ZIKV药物筛选并对其作用机制进行研究。首先利用碱性磷酸酶偶联聚合酶检测法建立NS5RdRp蛋白活性检测方法，并在此基础上建立NS5RdRp抑制剂筛选模型。然后利用此模型对化合物库进行筛选，得到一个对NS5RdRp具有较好抑制作用的小分子化合物UA(IC50=1.13μM)。同时我们选择HCVRdRp抑制剂索非布韦的体内活性产物(PSI-7409)作为对照，发现PSI-7409在该模型上并没有明显的NS5RdRp抑制活性。然后，我们运用计算机辅助药物设计的方法找到了UA与NS5RdRp蛋白作用的关键氨基酸D535。运用表面等离子体共振(SPR)实验分别检测UA与NS5RdRp以及突变体(D535A-RdRp)的亲和力，我们发现UA与NS5RdRp蛋白直接结合，而UA与D535A-RdRp蛋白亲和力不佳。同时发现PSI-7409与NS5RdRp蛋白之间没有亲和力。由此，我们推测UA抑制RdRp的方式可能与索非布韦不同。最后，我们测定了UA和PSI-7409的抗寨卡病毒活性，发现两者具有相当的抗ZIKV活性。综上，本研究发现了一个针对寨卡病毒NS5RdRp的蛋白抑制剂UA，该化合物作用机制区别于已有的NS5RdRp蛋白抑制剂索非布韦，并且UA具有较好的抗寨卡病毒活性。本研究为抗寨卡病毒药物研究提供了新的依据。 第二部分:以FtsZ蛋白为靶点的抗结核分枝杆菌先导化合物研究 近年来，随着多药耐药结核以及合并感染的出现，抗结核治疗面临着严峻的考验。研发新型高效低毒的抗结核药物是解决结核耐药问题的关键。丝状温度敏感蛋白Z(FtsZ)是细菌的菌体分裂蛋白，在细菌分裂过程中，发挥其GTP酶活性，在菌体中心形成动态的Z环，促使细菌菌体分裂。细菌的FtsZ蛋白是真核细胞微管蛋白Tubulin的对等蛋白，两者功能相似，结构差异大，是抗菌药物筛选的重要靶点，因此本研究选择结核杆菌FtsZ(Mtb-FtsZ)为靶点筛选抗结核分枝杆菌先导化合物。首先建立Mtb-FtsZ的GTP酶抑制剂筛选模型，对化合物库进行筛选，同时联用耻垢分枝杆菌进行表型筛选，得到了化合物146E12。146E12不仅能抑制Mtb-FtsZ的GTP酶活性，还能抑制Mtb-FtsZ的聚合功能。通过计算机辅助药物设计的方法，模拟Mtb-FtsZ蛋白与146E12的结合方式，找到两者的关键氨基酸Asn22。对Asn22进行点突变，并检测146E12对突变蛋白功能的影响，进一步验证了Asn22为146E12与Mtb-FtsZ作用的关键氨基酸。通过建立Mtb-FtsZ过表达株，进一步验证了146E12的作用靶点可能为Mtb-FtsZ。更重要的是146E12有较好的抗结核杆菌的活性，其抗结核活性与异烟肼和利福平等一线抗结核药相当，但对多药耐药结核杆菌和广泛耐药结核杆菌却有相对更好的抑制活性。146E12对其他菌株和细胞没有明显抑制活性。综上所述，结核分枝杆菌Mtb-FtsZ的GTP酶活性抑制剂146E12是一个良好的新型抗结核化先导合物。
寨卡病毒;抗感染药物;结核分枝杆菌;先导化合物进;GTP酶活性抑制剂
中国医学科学院北京协和医学院
硕士
药学
韩燕星
2019
中文
R96
2020-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）